金銀花中綠原酸的微波輔助提取工藝研究

李燕婷，周文富

(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程系，福建 三明 365004)

金銀花，別名忍冬，是忍冬科多年生半常綠纏繞木質(zhì)藤本植物[1～4]。金銀花為干燥花蕾或初開的花，在我國東三省、廣東、海南、山東、喜馬拉雅山均有廣泛分布。金銀花甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)可以祛邪，還可散風(fēng)熱，對發(fā)疹、發(fā)斑、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥均有明顯療效[5～10]，是清熱解毒的良藥。金銀花的特征活性成分為綠原酸，其結(jié)構(gòu)式如下[1]：

綠原酸是含有羧基和鄰二酚羥基的有機(jī)酸，易溶于水、醇、丙酮等[5～7]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、提高白細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、增香護(hù)色等作用[5～12]，廣泛應(yīng)用于食品保鮮及化妝品行業(yè)。綠原酸是很多藥材和中成藥抗菌解毒、消炎利膽的主要成分。

綠原酸的提取一般采用煎煮法、浸漬法、回流法[3，4，13，14]、沉淀法、萃取法、層析法等。但這些常規(guī)的提取分離方法均有不足之處，如煎煮法和浸漬法提取率較低、溶劑用量極大、耗時(shí)較長；回流法需要加熱，耗時(shí)較長；沉淀法分離效果不好；萃取法所需溶劑用量大；層析法成本高、操作復(fù)雜[2]。微波輔助提取法是近幾年發(fā)展起來的提取植物有效成分的一種新技術(shù)，微波對細(xì)胞具有破壁作用和加熱作用，能加速細(xì)胞內(nèi)藥物成分的快速溶出，具有穿透力強(qiáng)、節(jié)能、省時(shí)、提取率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取。

作者在此采用微波輔助法提取金銀花中的綠原酸，并對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，擬為金銀花的綜合利用提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

金銀花，產(chǎn)自福建三明，秋季。

98%綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；95%乙醇、固體氫氧化鈉，分析純；37%鹽酸溶液、乙酸乙酯溶液，化學(xué)純。

NT207型實(shí)驗(yàn)專用微波爐；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利公司；FA1604N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博經(jīng)經(jīng)貿(mào)公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?；|試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；玻璃儀器氣流烘干器，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；360型FTIR紅外光譜儀，英國Nicolet公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津蘇州儀器公司。

1.2 方法[8，9]

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加適量0.2 mol·L-1鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到0.05 mg·mL-1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分置于10 mL容量瓶中，加入適量0.2 mol·L-1鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻，靜置數(shù)分鐘，以不加綠原酸的試劑作空白對照。用紫外可見分光光度計(jì)在324 nm處測定吸光度[15]，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 綠原酸的提取

將洗凈、干燥的金銀花用攪拌機(jī)粉碎，過40目篩，備用。

分別配制50%氫氧化鈉溶液、0.2 mol·L-1鹽酸溶液、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液。

準(zhǔn)確稱取金銀花1 g，按照下列流程制取樣品溶液：金銀花→粉碎→浸漬→調(diào)節(jié)pH值→微波浸提→減壓抽濾→循環(huán)一次→調(diào)節(jié)pH值→萃取→調(diào)節(jié)pH值→定容至100 mL。趁熱減壓抽濾，將濾液移至梨形分液漏斗中加石油醚純化脫除雜質(zhì)，移至100 mL容量瓶定容后搖勻，作為供試液備用。

準(zhǔn)確吸取供試液0.5 mL，置10.00 mL容量瓶中，按1.2.1方法測定吸光度。根據(jù)回歸方程，計(jì)算樣品中綠原酸濃度，按下式計(jì)算綠原酸的提取率：

式中：X為綠原酸提取率，%；c為綠原酸濃度，μg·mL-1；W為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

準(zhǔn)確稱取樣品5.00 mg，定容至100 mL容量瓶中。搖勻，靜置數(shù)分鐘，以試劑空白溶液作對照品，用紫外可見分光光度計(jì)于200～500 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明：樣品溶液在波長324 nm處有最大吸收峰。因此，選擇324 nm作為檢測波長。

2.2 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程為：A=0.6208c-0.4924，R2=0.9912。

2.3 綠原酸的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 紅外光譜分析

精密稱取樣品0.1 g，研細(xì)后用溴化鉀壓片，置于紅外光譜儀下測試，結(jié)果見圖2。

圖2 綠原酸樣品(a)與標(biāo)準(zhǔn)品(b)的紅外光譜

由圖2可知，綠原酸樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖基本一致。3373 cm-1處為-OH的吸收峰，3030 cm-1處為苯環(huán)C-H的伸縮振動(dòng)峰，1687 cm-1處為-C=O的伸縮振動(dòng)峰，1638 cm-1、1602 cm-1處為C=C的伸縮振動(dòng)峰，1600 cm-1、1580 cm-1、1500 cm-1、1450 cm-1處為苯環(huán)骨架C=C的伸縮振動(dòng)峰，1457 cm-1、1398 cm-1處為-CH3的彎曲振動(dòng)峰，1288 cm-1處為C-O的伸縮振動(dòng)峰，1085 cm-1處為C-O-C的伸縮振動(dòng)峰。

2.3.2 紫外光譜分析

精確稱取樣品5.00 mg，溶于100 mL容量瓶中，以試劑空白溶液作對照品，置于紫外光譜儀下測試，結(jié)果見圖3。

圖3 綠原酸樣品(a)與標(biāo)準(zhǔn)品(b)的紫外光譜

由圖3可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在300～350 nm有一個(gè)吸收峰，綠原酸樣品在300～350 nm也有吸收峰且吸收峰的位置、形狀和強(qiáng)度與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品非常相似。這表明實(shí)驗(yàn)所得綠原酸的骨架和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品相似。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取效果的影響

稱取金銀花1.0000 g，在料液比為1∶10(g∶mL，下同)、微波處理時(shí)間為3 min、微波功率為200 W的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取率的影響

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，金銀花綠原酸提取率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率最高。這是由于，綠原酸是含有羧基和鄰二酚羥基的有機(jī)酸，極性與乙醇相對接近，根據(jù)相似相溶原則，綠原酸能溶于乙醇溶液；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí)，乙醇水溶液的極性相對偏低，則綠原酸的溶解度也降低，且乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，還會(huì)使金銀花中某些脂質(zhì)性物質(zhì)溶出增多，競爭同乙醇溶劑的結(jié)合，導(dǎo)致綠原酸提取率的降低。因此，選取60%、70%、80%為乙醇體積分?jǐn)?shù)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 料液比對綠原酸提取效果的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波處理時(shí)間為3 min、微波功率為200 W的條件下，考察料液比對綠原酸提取效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對綠原酸提取率的影響

由圖5可知，綠原酸提取率隨著料液比的減小(即提取劑用量的增大)呈先降低后升高的趨勢，在料液比為1∶10時(shí)，提取率最高。這是因?yàn)?，提取劑用量增大，?huì)增加對微波能的吸收，導(dǎo)致所需物質(zhì)對微波能吸收相應(yīng)減少，細(xì)胞壁破裂不完全，綠原酸就不能從細(xì)胞中充分溶出。因此，選取提取率較高的料液比水平即1∶10、1∶20、1∶30進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 微波功率對綠原酸提取效果的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波處理時(shí)間為3 min、料液比為1∶10的條件下，考察微波功率對綠原酸提取效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 微波功率對綠原酸提取率的影響

由圖6可知，隨著微波功率的增大，綠原酸提取率呈先降低后升高的趨勢，當(dāng)微波功率大于225 W后綠原酸提取率隨微波功率的增大而升高。這可能是因?yàn)?，增大微波功率，微波加熱的速率加快，分子的運(yùn)動(dòng)速度相應(yīng)加快，物質(zhì)之間的摩擦增加，物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散和溶解速度加快，有利于綠原酸由金銀花的外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到乙醇溶劑中，但若微波功率過大，金銀花中的鞣質(zhì)、黃酮和木犀草黃素等粘液雜質(zhì)也會(huì)大量溶出，溶在乙醇中且不能很好地去除。因此，選取250 W、275 W、300 W為微波功率水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4.4 微波處理時(shí)間對綠原酸提取效果的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波功率為300 W、料液比為1∶10的條件下，考察微波處理時(shí)間對綠原酸提取效果的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 微波處理時(shí)間對綠原酸提取率的影響

由圖7可知，隨微波處理時(shí)間的延長，綠原酸提取率先升高后降低，在微波處理時(shí)間為7 min時(shí)，綠原酸提取率最高。這可能是由于，微波輻射在短時(shí)間內(nèi)對金銀花細(xì)胞膜的破碎作用較大，所溶出的物質(zhì)較多，所以綠原酸提取率起初隨著微波處理時(shí)間的延長而升高。但是長時(shí)間微波輻射產(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)會(huì)破壞綠原酸成分，導(dǎo)致提取率下降，且微波處理時(shí)間越長，溶劑揮發(fā)越多；綠原酸的穩(wěn)定性也由于長時(shí)間浸在溶液中受到影響。因此，選取5 min、7 min、9 min為微波處理時(shí)間水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波處理時(shí)間、料液比、微波功率作為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以綠原酸提取率為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，其因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，各因素對金銀花綠原酸提取率的影響大小依次為：微波處理時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波功率>料液比，其中微波處理時(shí)間影響最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率次之，料液比影響最小。最佳提取工藝為A1B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波處理時(shí)間為9 min、料液比為1∶10、微波功率為300 W。

為了驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波處理時(shí)間為9 min、料液比為1∶10、微波功率為300 W的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行做2組，平均提取率為3.779%。

3 結(jié)論

(1)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定微波輔助提取金銀花中綠原酸的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波處理時(shí)間9 min、微波功率300 W、料液比1∶10(g∶mL)，此時(shí)，提取率為3.779%。

(2)未除凈的色素(如葉黃素、葉綠素、胡蘿卜素等)基團(tuán)可與顯色劑顯色，導(dǎo)致吸光度增大、提取率假性升高，趁熱抽濾后的粗產(chǎn)品的純化去除脂溶性色素也是影響產(chǎn)品得率的關(guān)鍵因素。

(3)微波法與傳統(tǒng)提取方法相比，操作時(shí)間明顯縮短，且無需回收溶劑，具有省時(shí)、高效、節(jié)能、少污染、低成本的優(yōu)點(diǎn)。

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