朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王曉梅，袁菊麗

(寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工系 陜西省植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013)

隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率日趨升高。糖尿病主要是由于體內(nèi)胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足所引起的糖代謝紊亂所致。降低餐后血糖、減少并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病治療的重要內(nèi)容。中藥治療糖尿病雖然降糖效果較西藥弱，但療效穩(wěn)定、作用溫和、不良反應(yīng)少，能有效防治并發(fā)癥。近年來，從中草藥及其提取物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究引起了很多學(xué)者的關(guān)注并取得了一定進(jìn)展[1～3]。

朱砂七為蓼科植物毛脈蓼[Polygonumcillinerve(Nakai)Ohwi]的干燥塊根，主產(chǎn)于陜西秦嶺，是“太白七藥”之一。朱砂七含有多種活性成分，具有清熱解毒、涼血利咽、止血止瀉、祛風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝、抗腫瘤的功效[4，5]。

作者在此分別提取朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖，考察其對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用，擬為探討其降糖機(jī)理及擴(kuò)大朱砂七的治療范圍提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

朱砂七購自太白山區(qū)，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院胡本祥教授鑒定。

α-葡萄糖苷酶，美國Sigma公司；對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，純度99%)，美國Merck公司；二甲基亞砜(DMSO)，萊陽化工實(shí)驗(yàn)廠；去離子水，自制；其余試劑均為市售分析純。

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BS-244-SS型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 朱砂七提取物的制備

1.2.1.1 朱砂七鞣質(zhì)的提取

稱取粉碎的50 g朱砂七，加入750 mL 60%乙醇，于70 ℃下超聲提取2次，每次50 min。合并2次提取液，抽濾，棄去殘?jiān)瑢V液減壓蒸餾，回收乙醇，餾分即為鞣質(zhì)粗液。加入等體積乙醚萃取，分出水液層，再用等體積乙酸乙酯萃取，水液層經(jīng)減壓濃縮得朱砂七鞣質(zhì)，乙酸乙酯層經(jīng)減壓濃縮、回收乙酸乙酯而得朱砂七鞣質(zhì)。

1.2.1.2 朱砂七多糖的提取

稱取60 g朱砂七，加入600 mL蒸餾水，于95 ℃回流提取2 h，收集提取液，藥渣如法再次提取。合并2次提取液，減壓濃縮，向濃縮液加入95%乙醇至乙醇濃度為80%，靜置過夜，抽濾，收集濾渣。用95%乙醇、石油醚、乙醚依次洗滌，在50 ℃的干燥箱中烘干而得朱砂七多糖。

1.2.2 朱砂七提取物的分析檢測

朱砂七鞣質(zhì)檢測采用醋酸鋅絡(luò)合滴定法及磷鉬鎢酸比色法。

朱砂七多糖檢測采用硫酸-蒽酮法、α-萘酚法。

1.2.3 朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

參照文獻(xiàn)[6，7] ，測定朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酶活力單位定義為：37 ℃、pH值6.8條件下，每分鐘水解pNPG釋放1 μmol 對(duì)硝基苯酚(pNP)所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

向10 mL試管中依次加入pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液1.85 mL、0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶50 μL、不同濃度(0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.5 mg·mL-1) 的朱砂七提取物溶液50 μL、0.0116 mol·L-1pNPG 50 μL，將上述反應(yīng)體系在37 ℃保溫30 min后，加入0.1 mol·L-1Na2CO3溶液8 mL終止反應(yīng)，然后在400 nm波長處測吸光度(A)。朱砂七提取物終濃度分別為0 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.5 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、15.0 μg·mL-1和17.5 μg·mL-1。每個(gè)濃度體系同時(shí)作3個(gè)平行，取平均值。同時(shí)設(shè)不加酶的樣品空白組、不加樣品的無樣品組、不加樣品和酶的無樣空白組。

按下式計(jì)算朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。通過Prism軟件求出IC50值。

式中：A樣品為加入朱砂七提取物后酶反應(yīng)的吸光度值；A樣品空白為體系中加入朱砂七提取物但未加酶的吸光度值；A無樣品為酶與底物反應(yīng)后的吸收度值；A無樣空白為體系中既無朱砂七提取物也無酶的吸光度值。

1.2.4 朱砂七提取物的抑制動(dòng)力學(xué)研究

取不同濃度(0 mg·mL-1、1 mg·mL-1、2 mg·mL-1) 的朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖，再分別加入不同濃度的底物(0.05 mol·L-1、0.1 mol·L-1、0.15 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.25 mol·L-1)，測定反應(yīng)速度，用Lineweaver-Burk作圖法確定抑制類型。

2 結(jié)果與討論

2.1 朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(圖1)

圖1 朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均有抑制作用，且抑制作用均隨提取物濃度的增大而增大。朱砂七鞣質(zhì)濃度為15.0 μg·mL-1時(shí)抑制率最大，為91.3%；濃度繼續(xù)增大，抑制率無明顯變化，IC50值為1.6 μg·mL-1。而朱砂七多糖的抑制作用明顯較朱砂七鞣質(zhì)弱，當(dāng)濃度為15.0 μg·mL-1時(shí)抑制率最大，為41.18%；濃度繼續(xù)增大，抑制率無明顯變化，IC50值為1.3 μg·mL-1。

2.2 朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型的測定

在含不同濃度朱砂七鞣質(zhì)的測活體系中，改變底物濃度([S])，測定酶促反應(yīng)的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，結(jié)果見圖2。

圖2 朱砂七鞣質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的判斷

由圖2可知，得到一組相交于x軸的直線，直線斜率隨樣品濃度的變化而改變，最大反應(yīng)速度(vmax)隨樣品濃度的變化而改變，而米氏常數(shù)(Km)不變。這可能是因?yàn)轺焚|(zhì)是多元酚類化合物，易與酶蛋白活性中心以外的多個(gè)部位結(jié)合，進(jìn)而引起酶蛋白發(fā)生構(gòu)象改變以至于活性降低，而對(duì)酶與pNPG的結(jié)合影響不大。由此判斷朱砂七鞣質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理當(dāng)屬非競爭性抑制類型。

在含不同濃度朱砂七多糖的測活體系中，改變底物濃度，測定酶促反應(yīng)的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 朱砂七多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的判斷

由圖3可知，得到一組相交于左上象限的直線，直線斜率隨樣品濃度的變化而改變，vmax隨樣品濃度的變化而改變，Km值隨樣品濃度的增大而增大。這可能是因?yàn)樗崛〉亩嗵菫榛旌闲猿煞?，所含多糖種類較混雜，多糖與酶的結(jié)合位點(diǎn)可能為活性中心及活性中心以外的部位。由此判斷朱砂七多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理當(dāng)屬綜合性抑制類型。

3 結(jié)論

分別提取朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖，以對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物，考察朱砂七提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中朱砂七鞣質(zhì)的抑制作用較朱砂七多糖更強(qiáng)；朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的最大抑制率分別為91.3%和41.18%，IC50值分別為1.6 μg·mL-1和1.3 μg·mL-1。朱砂七鞣質(zhì)和朱砂七多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制機(jī)理分別屬于非競爭性抑制類型和綜合性抑制類型。

[1]張冉，劉泉，申竹芳，等.應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型篩選降血糖中藥[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42(10)：740-742.

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