人乳鐵蛋白肽的分子改良及在大腸桿菌中的表達研究

蔡 屾，葉 江，張惠展

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

當前，由于抗生素的濫用而造成細菌耐藥性的形成使細菌性感染和疾病呈上升趨勢。在尋求新型抗菌策略的研究中，抗菌肽因其非特異性的作用方式，使病原微生物對其不能產生抗性，優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。其中乳鐵蛋白肽不含稀有氨基酸及外源化學成分，安全、健康，具有替代抗生素的巨大潛在優(yōu)勢[1]。

乳鐵蛋白肽是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶水解，從其N端解離出的一段多肽，具有廣譜的抑菌和殺菌能力，能抑制真菌和病毒的增殖、抑殺癌細胞等[2，3]。hLF18-40是人乳鐵蛋白肽(Human lactoferrin)N端18～40位氨基酸組成的抗菌肽，其氨基酸序列為：TKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR，具有抗賈第蟲及抑制白色念珠菌的活性，對包括氟康唑和二性霉素B抗性分離菌株在內的所有念珠菌屬菌株都有抗性。hLF18-40對白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)為18.7 μmol·L-1；且在高鹽濃度(60 mmol·L-1NaCl溶液)下仍能發(fā)揮抑菌活性；殺菌機制是通過破壞白色念珠菌的細胞膜而致其死亡[4]。此外，hLF18-40對大腸桿菌也有抑制作用，小鼠口服hLF18-40后，腎臟分泌可將其轉移到感染位點從而發(fā)揮抗感染及抗炎功效[5]。

作者在此采用大腸桿菌系統(tǒng)表達人乳鐵蛋白肽，以期實現(xiàn)其高效表達；同時對人乳鐵蛋白肽hLF18-40的抑菌活性進行研究，以期尋找具有抗菌活性的最短抗菌肽。

1 實驗

1.1 材料

革蘭氏陰性菌EscherichiacoliATCC25922、EscherichiacoliJM83、EscherichiacoliBL21(DE3)均為自行保存。酵母粉等LB培養(yǎng)基成分購自UNIPATH公司，MH肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司。質粒抽提等試劑盒購自捷瑞公司。

1.2 引物的設計

選用pET-43.1a(+)和pET-41b(+)質粒作為表達載體構建表達盒。設計引物時，根據(jù)Fast Seamless Cloning技術的要求，在目的基因的前后兩端均添加表達載體的同源序列；同時，根據(jù)重疊區(qū)基因擴增拼接法(SOE-PCR)的技術要求，各引物之間相互重疊15 bp左右。以pET-43.1a(+)為載體設計引物：

TGATGACGACGACAAGACCAAATGCTTTCAGTGGCAGCGCAACATGCGCAAAGTGCGCGGCCCGCCGGTGAGCTGCATCAAACGCTAAAGTCCGGGAGCTCGT

ACTACTGCTGCTGTTCTGGTTTACGAAAGTCACCGTCGCGTTGTACGCGTTTCACGCGCCGGGCGGCCACTCGACGTAGTTTGCGATTTCAGGCCCACGAGCA

1.3 DNA的同源重組

按摩爾比1∶3將線性化質粒與外源DNA混合，在Fast Seamless Cloning Enzyme的作用下進行同源重組克隆，反應條件為25 ℃溫育30 min。

1.4 融合蛋白的表達純化

在新鮮的LB培養(yǎng)基中將重組菌及對照菌培養(yǎng)至OD600為0.6左右時，加入IPTG誘導表達(終濃度為1 mmol·L-1)，在誘導0.5 h、2.5 h、4.5 h后，分別適當取樣，測定OD600，以新鮮的LB培養(yǎng)基為對照。收集菌體，洗滌、懸浮、超聲破碎，離心收集超聲上清液。

Ni2+柱親和層析：將Ni2+裝柱后，用10 BV的NTA-0緩沖溶液平衡Ni2+柱；將上述超聲上清液注入平衡好的Ni2+柱使其牢固結合；再用10 BV的NTA-0緩沖溶液洗滌；最后依次用5 BV的NTA-20、NTA-30、NTA-50、NTA-200緩沖溶液洗脫，收集各梯度洗脫液，用SDS-PAGE分析蛋白質的分布。

1.5 融合蛋白的切割

用腸激酶切割融合蛋白，25 ℃溫育16 h。反應體系如下：10×重組牛腸激酶反應緩沖溶液5 μL；融合蛋白40 μL；重組牛腸激酶0.5 U；ddH2O 4.5 μL；總體積50 μL。

1.6 最小抑菌濃度測定[6]

人乳鐵蛋白肽hLF18-40及其8條改良肽的MIC采用微量肉湯稀釋法[4]測定。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液稀釋至2×105～7×105cfu·mL-1；用PBS(磷酸鈉緩沖溶液，pH值7.0)將抗菌肽配制為最高待測濃度10倍的儲備液，再進行梯度稀釋，得到系列稀釋濃度的抗菌肽溶液；向無菌的96孔聚丙烯培養(yǎng)板中的1～10孔分別加入100 μL稀釋的菌懸液，11孔加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基；再向1～10孔分別加入10 μL相應濃度的待測抗菌肽，11孔加入10 μL無菌蒸餾水作為細菌陽性對照；將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)24 h后觀察結果。以能阻止細菌生長的最小抗菌肽濃度作為MIC。

2 結果與討論

2.1 hLF18-40重組表達質粒的構建

根據(jù)設計好的各引物，以SOE-PCR技術進行擴增，結果見圖1。

1，2.以pET-43.1a(+)為載體的PCR產物 M.DNA Marker

由圖1可看出，PCR反應產物在107 bp處有粗而明亮的DNA條帶，濃度較高，表明基因擴增效果較好。

用PshAⅠ酶切得到線性化的pET-43.1a(+)，再與PCR產物在Fast Seamless Cloning Enzyme的作用下進行同源重組克隆。轉化后以PCR法對重組子進行篩選，并經(jīng)測序鑒定出正確陽性克隆。

2.2 融合蛋白的表達純化

以IPTG誘導重組菌pET-43.1a-hLF18-40/BL21(DE3)進行表達，結果見圖2。

1～4.誘導0 h、0.5 h、2.5 h、4.5 h的pET-43.1a-hLF18-40/BL21(DE3) M.DNA Marker

由圖2可看出，pET43.1a-hLF18-40/BL21(DE3)得到了明顯的表達產物條帶，且蛋白條帶大小與理論值63.2 kDa相一致。

由于融合蛋白上有His· Tag標記，因此可采用Ni2+柱親和層析的方法進行純化，結果見圖3。

1.pET43.1a-hLF18-40超聲上清 2.pET43.1a-hLF18-40超聲沉淀 3.超聲上清 4.流穿液 5.洗滌液 6～9.咪唑洗脫液，濃度(mmol·L-1)分別為20、30、50、200 M.DNA Marker

由圖3A可以看出，融合蛋白Nus-hLF18-40均存在于超聲上清液中，由圖3B可以看出，當咪唑洗脫液的濃度為50 mmol·L-1時可以得到較高濃度的目的蛋白，且雜蛋白較少。收集含目的蛋白的該洗脫液后，用超濾離心管濃縮除鹽，Bradford法測定其蛋白濃度為4.62 mg·mL-1。

2.3 融合蛋白Nus-hLF18-40的裂解

用腸激酶切割融合蛋白可將hLF18-40與Nus分離，理論上腸激酶切割后的Nus為60.4 kDa、hLF18-40為2.8 kDa，取腸激酶酶切液進行Tricine-SDS-PAGE分析；同時將化學合成的hLF18-40溶解于磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.0)中，得到的0.4 mmol·L-1蛋白溶液作為對照，為了突出比較多肽的大小，將一條相同濃度的2 kDa的人乳鐵蛋白肽作為對照，結果見圖4。

由圖4可以看出，腸激酶酶切液中出現(xiàn)了與化學合成的hLF18-40同樣大小的條帶，與酶切之前相比，大片段的條帶有所減少，說明腸激酶已將Nus-hLF18-40完全切開，釋放出了hLF18-40。

2.4 人乳鐵蛋白肽hLF18-40的分子改良研究

據(jù)報道，hLF18-31對E.coliATCC25922無抑制作用。為了探索具有抑菌活性的最短人乳鐵蛋白肽，將hLF18-40的C末端氨基酸逐一縮短，化學合成hLF18-40～hLF18-32共9條肽。采用改進微量肉湯稀釋法對以上9條肽進行抑菌活性測定，指示菌為E.coliATCC25922，結果見表1。

表1 抗菌肽的氨基酸序列和體外最小抑菌濃度

由表1可知，hLF18-40的C末端縮短一個氨基酸(hLF18-39)時，其抑菌活性有所上升，MIC略微降低；再繼續(xù)縮短，抑菌活性逐漸下降，MIC逐漸增大；但縮至hLF18-35時，抑菌活性又突然上升，MIC與hLF18-40相同；而與其只相差一個氨基酸的hLF18-34的抑菌活性卻迅速下降，直到hLF18-32，抑菌活性均較低。

2.5 討論

首先，利用基因工程技術在大腸桿菌中表達hLF18-40，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏愛性，采用重疊區(qū)基因擴增拼接法，設計并合成了hLF18-40的編碼基因；采用融合表達策略，利用基因同源重組技術構建了hLF18-40的大腸桿菌表達質粒pET-43.1a-hLF18-40，并將質粒轉入宿主菌BL21(DE3)中表達，結果顯示hLF18-40在pET-43.1a(+)中獲得了較高的可溶性融合表達；最后將融合蛋白Nus-hLF18-40進行Ni2+柱親和層析，平均每升細菌培養(yǎng)物獲得約150 mg融合蛋白，純度達到了85%以上，經(jīng)進一步的除鹽和濃縮后，腸激酶切割釋放抗菌肽hLF18-40，濃度約為0.76 mg·mL-1。

其次，將hLF18-40的C末端氨基酸逐一縮短直至hLF18-32，用化學法合成hLF18-40、hLF18-39、hLF18-38、hLF18-37、hLF18-36、hLF18-35、hLF18-34、hLF18-33和hLF18-32共9條人乳鐵蛋白肽，采用改進微量肉湯稀釋法分別測定以上9條肽對E.coliATCC25922的MIC。結果發(fā)現(xiàn)，去掉hLF18-40 C端的Arg后其抑菌活性有所上升(20 μmol·L-1

3 結論

建立了人乳鐵蛋白肽hLF18-40的大腸桿菌表達系統(tǒng)，模擬其重組異源表達及規(guī)?；a的各個工藝環(huán)節(jié)，解決可能出現(xiàn)的技術問題，打通整條工藝路線，包括構建重組表達質粒、融合蛋白分離純化、目的蛋白切割釋放，為今后基因工程法表達人乳鐵蛋白肽提供了依據(jù)；同時對hLF18-40進行分子改良，探索其活性變化，得到了具有抑菌活性的最短抗菌肽hLF18-35，為進一步提高其抑菌活性奠定了基礎。

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