氨氧化古菌生態(tài)學(xué)及其在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的研究進(jìn)展

馬 婷，趙大勇，曾 巾，燕文明，姜翠玲，黃 睿，王 猛

(1.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京210098；2.河海大學(xué) 水文水資源與水利工程科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210098；3.中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所 湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008)

自100多年前細(xì)菌氨氧化作用首次被發(fā)現(xiàn)以來，氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB)一直被認(rèn)為是氨氧化過程的主要驅(qū)動者[2]。近年來，隨著不依賴于培養(yǎng)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)了另一類具有氨氧化能力的微生物——氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)。AOA是一類完全獨(dú)立于AOB的進(jìn)化類群，廣泛分布于海洋[3]、土壤[4]、湖泊[5，6]、溫泉[7，8]和礦區(qū)[9，10]等多種生態(tài)系統(tǒng)中，在地球氮循環(huán)中可能起著非常重要的作用。目前，對氨氧化古菌的研究主要集中在土壤和海洋生態(tài)系統(tǒng)中，而僅有少數(shù)研究涉及湖泊生態(tài)系統(tǒng)[5，6]。作者在此主要概述了氨氧化古菌的生態(tài)分布、系統(tǒng)發(fā)育、豐度及環(huán)境影響因子，重點(diǎn)綜述了氨氧化古菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展。

1 氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)

氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase，AMO)是氨氧化過程的關(guān)鍵酶，由于氨單加氧酶基因之一的amoA具有較強(qiáng)的保守性，因而常被作為研究氨氧化微生物的分子標(biāo)記[2]。

2004年，Venter等[11]用鳥槍法對馬尾藻(Sargasso)的環(huán)境基因組進(jìn)行測序分析后首次發(fā)現(xiàn)泉古菌擁有amoA基因。2005年，Treusch等[12]在土壤宏基因組片段中也發(fā)現(xiàn)泉古菌amoA基因，并從土壤中分離到amoA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這兩個研究揭示了未培養(yǎng)的泉古菌中氨氧化基因的存在，不過僅從基因序列信息還不能完全斷定泉古菌是否可以進(jìn)行氨氧化作用[13]。同年，K?nneke等[14]從海水中成功分離出第一株AOA——Nitrosopumilusmaritimus，該菌具有氨單加氧酶基因的所有成員amoA、amoB和amoC，且以氨為唯一能源進(jìn)行自養(yǎng)生長。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地證明了AOA在自然界中的真實(shí)存在，并證實(shí)了泉古菌amoA基因與氨氧化作用之間的關(guān)系。Francis等[3]將這類具有氨氧化能力的泉古菌稱為AOA。自此，AOA的氨氧化作用引起了全世界的廣泛關(guān)注。

2 氨氧化古菌分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展

2.1 氨氧化古菌生態(tài)分布

2005年，F(xiàn)rancis等[3]率先利用AOA的amoA基因的特異性引物Arch-amoAF和Arch-amoAR對海水及其沉積物等環(huán)境樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證實(shí)了AOA在海洋環(huán)境中普遍存在。隨后，這對引物被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境中AOA的研究，結(jié)果顯示，AOA在全球生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，存在于廢水處理器[15]、土壤[4]、河口沉積物[16]、深海沉積物[17]、海洋功能組織(珊瑚、海綿)[18，19]、陸地溫泉[7，8]、礦區(qū)[9，10]和淡水湖泊[5，6]等不同環(huán)境中。

2.2 氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，AOA和AOB的amoA基因在進(jìn)化樹上分歧成不同分支，說明雖然它們可能起源于同一祖先，但在地球早期就已經(jīng)分支進(jìn)化成不同類群[20]。Klotz等[21]通過基因組分析發(fā)現(xiàn)，AOA的氨氧化功能在進(jìn)化時間上要晚于AOB。

根據(jù)AOA的amoA基因序列變異及其所棲息的生態(tài)環(huán)境，可將其分為3大類：海洋環(huán)境硝化古菌群落、土壤環(huán)境硝化古菌群落和嗜高溫環(huán)境硝化古菌群落[22]。

基于16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，AOA按生態(tài)來源的不同聚類于泉古菌的不同分支：海洋、大多數(shù)水體以及沉積物來源的AOA聚類于Group 1.1a；土壤及其它陸源環(huán)境來源的AOA聚類于Group 1.1b[23]；嗜高溫AOA 在amoA系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個獨(dú)立于海洋和土壤分支的進(jìn)化分支。

研究表明，AOA的amoA基因和基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育重合性很好。另外，研究發(fā)現(xiàn)Group 1.1c類群可能也參與了氨氧化過程，但還沒有發(fā)現(xiàn)與之對應(yīng)的amoA序列[24]。值得注意的是，相當(dāng)一部分的海洋泉古菌可能并不含有功能基因amoA[25]。

2.3 氨氧化古菌豐度和對硝化作用的相對貢獻(xiàn)

Herrmann等[6]對湖泊環(huán)境的研究表明，AOA在自然環(huán)境中不僅分布廣泛，而且在數(shù)量上通常也明顯超過AOB，最大差別達(dá)8000倍。Leininger等[4]研究發(fā)現(xiàn)，土壤環(huán)境中AOA的amoA基因數(shù)量最高可達(dá)AOB的3000倍。Mincer等[24]和Wuchter等[26]研究發(fā)現(xiàn)，海洋環(huán)境中AOA的amoA基因拷貝數(shù)要高出AOB的1～3個數(shù)量級。然而，也有報道表明微好氧條件下海灣沉積物中AOB的amoA數(shù)量高于AOA[27]?？偟膩碚f，AOA豐度高于AOB，是地球上最豐富的氨氧化微生物[17，20，24，26]。

根據(jù)目前的研究，AOA豐度顯著高于AOB，但兩者對硝化作用的相對貢獻(xiàn)大小卻不確定。2007年，Lam等[28]對黑海的研究表明，AOA為厭氧氨氧化過程提供了大約一半的亞硝酸鹽。Church等[29]研究發(fā)現(xiàn)，太平洋中上層海域中絕大多數(shù)泉古菌都參與了氨氧化過程，并且這些AOA是海洋硝化作用非?；钴S的貢獻(xiàn)者。2009年，純培養(yǎng)的研究表明[30]，AOA對銨態(tài)氮的氧化具有較高的競爭優(yōu)勢，在原位海洋硝化過程中發(fā)揮著重要作用，強(qiáng)有力地證實(shí)了AOA是貧營養(yǎng)生態(tài)環(huán)境中硝化過程的重要驅(qū)動者。

相對于海洋環(huán)境，土壤環(huán)境較為復(fù)雜，目前尚沒有關(guān)于純菌株或富集物的報道，土壤AOA的氨氧化動力學(xué)特點(diǎn)也不清楚。2009年，Offre等[31]利用不同濃度的乙炔來抑制土壤生態(tài)環(huán)境的氨氧化活性時，AOA的群落結(jié)構(gòu)相對AOB發(fā)生明顯響應(yīng)，表明AOA對土壤硝化過程起主要作用。同年，Di等[32]研究高氮草原土壤時發(fā)現(xiàn)，盡管所有采樣點(diǎn)的AOA豐度均較高，但其豐度和活性并沒有隨氮肥的施入而增大，反而AOB的豐度和活性與銨態(tài)氮濃度呈正相關(guān)。其最近的研究表明，在氨供給豐富的土壤中，AOB是硝化作用的主要驅(qū)動者，而在低氮或貧營養(yǎng)環(huán)境中，AOA可能對硝化作用貢獻(xiàn)較多[33]。

2.4 氨氧化古菌的環(huán)境影響因子

2.4.1 pH值

大量研究表明，pH值對AOA的生理代謝規(guī)律有重要影響。

2007年，He等[34]對我國酸性紅土(pH值3.7～6.0)的研究表明，AOA豐度與pH值呈正相關(guān)。2008年，Nicol等[35]研究表明AOA的amoA基因數(shù)量隨pH值的增大而減少。2009年，Jia等[36]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤硝化能力的增強(qiáng)，pH值和AOA的amoA基因數(shù)量都降低。此后，也有研究者對全球58種土壤[37]和54個溫泉[7]樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明AOA的豐度與pH值呈正相關(guān)。Shen等[38]對我國堿性砂質(zhì)土壤(pH值8.3～8.7)的研究表明，pH值對AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。也有報道顯示pH值與AOA的amoA數(shù)量并沒有顯著的線性關(guān)系[8，39]。

2.4.2 銨態(tài)氮濃度

2006年，Wuchter等[26]連續(xù)監(jiān)測北海沿岸海水發(fā)現(xiàn)，AOA的amoA基因數(shù)量與海水中銨態(tài)氮濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)。近年來，也有研究表明高濃度銨態(tài)氮可能抑制嗜溫AOA的氨氧化能力[40]。然而，Treusch等[12]對高鈣草原土壤的研究表明AOA豐度隨銨態(tài)氮濃度的升高而增大。

2.4.3 溫度

2008年，Urakawa等[41]研究表明，溫度會影響AOA的遺傳多樣性和群落結(jié)構(gòu)，且溫度越低，AOA的多樣性也越低。Tourna等[42]通過設(shè)置不同溫度的培養(yǎng)條件(10～30 ℃)發(fā)現(xiàn)AOA群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定差異。然而，基于AOA特異脂類的研究表明，部分土壤[4]、海洋[43]的AOA種群數(shù)量受溫度影響較小。

2.4.4 植物根際

Chen等[44]研究發(fā)現(xiàn)，水稻根際AOA的相對豐度要顯著高于非根際。Herrmann等[6]研究水生植物根際與非根際AOA時也得出類似結(jié)論，還發(fā)現(xiàn)不同類型水生植物根際AOA的amoA基因數(shù)量也不一樣。這可能是由于植物根際釋放氧氣，直接或間接影響了了AOA豐度。

2.4.5 其它環(huán)境因子

此外，鹽堿度[27]、土壤類型、施肥處理[34]和海洋水深[45]都可能影響AOA的群落結(jié)構(gòu)、多樣性或者豐度。

3 湖泊生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌的研究進(jìn)展

目前，對AOA的研究主要集中在土壤和海洋生態(tài)系統(tǒng)，僅有少數(shù)研究涉及湖泊生態(tài)系統(tǒng)。2008年，Auguet等[46]提出了研究湖泊生態(tài)系統(tǒng)中AOA的重要性。同年，Herrmann等[6]在7個貧營養(yǎng)或中營養(yǎng)的湖泊沉積物中發(fā)現(xiàn)了AOA，并證實(shí)了其在數(shù)量上占優(yōu)勢地位。隨后，越來越多的學(xué)者對湖泊生態(tài)系統(tǒng)中AOA進(jìn)行了詳細(xì)研究。

3.1 湖泊生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育

2010年，Wu等[47]對太湖沉積物AOA系統(tǒng)發(fā)育研究表明，所有AOA的amoA基因序列分屬Group 1.1b和Group 1.1a兩個主要分支，并以前者中的序列為主。如前述可知Group 1.1b廣泛分布于土壤中、Group 1.1a在海洋生態(tài)系統(tǒng)中更為常見，這可能與歷史上太湖地區(qū)經(jīng)歷多次海陸交替有關(guān)。而在太湖藍(lán)藻水華疊加后，沉積物表層AOA序列多屬于Group 1.1b，且AOA的物種多樣性減少，群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化[48]。

和諧度H取值介于0和1之間，和諧度越大，代表系統(tǒng)越和諧，H=1則代表系統(tǒng)處于完全和諧的理想狀態(tài)；0.8 <1，代表系統(tǒng)和諧狀態(tài)較好；0.6 <0.8，代表系統(tǒng)基本和諧； 0

同年，Llirós等[49]對Lake Kiku(剛果)水體進(jìn)行研究，基于AOA 16S rRNA基因序列分析表明，在好氧層發(fā)現(xiàn)AOA分屬Group 1.1b和Group 1.1a兩個分支，而厭氧層的AOA屬于泉古菌進(jìn)化樹幾個不同分支。

2011年，Auguet等[50]研究3個高山貧營養(yǎng)湖泊水體中AOA的季節(jié)性變化，發(fā)現(xiàn)大部分[(58±18)%]AOA屬于Group 1.1a分支。

3.2 湖泊水體中氨氧化古菌

2008年，Llirós等[51]研究發(fā)現(xiàn)，湖泊水體中AOA的相對豐度和分布隨季節(jié)發(fā)生變化，但應(yīng)用多變量統(tǒng)計分析的方法卻未發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著相關(guān)關(guān)系。

2009年，Jiang等[52]對青海湖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在水體好氧層，AOA相對豐度大于AOB，而在厭氧層，AOB相對豐度大于AOA，并且AOA群落結(jié)構(gòu)在水體和沉積物中是截然不同的。

同年，Callieri等[53]研究發(fā)現(xiàn)，AOA的相對豐度隨水深增加而增大，并呈現(xiàn)一定季節(jié)性變化。Pouliot等[54]在加拿大兩個極寒湖泊都發(fā)現(xiàn)了AOA的amoA基因，且其在氧躍層數(shù)量最多，說明AOA硝化作用在氧躍層最活躍，并發(fā)現(xiàn)AOA群落分布和組成在垂向呈現(xiàn)很大差異。

2010年，Llirós等[49]發(fā)現(xiàn)水體中AOA 16S rRNA基因和amoA基因拷貝數(shù)的垂向分布與硝酸鹽和亞硝酸鹽含量有關(guān)，表明在湖泊水體中AOA對硝化作用有潛在影響。

2011年，Auguet等[50]發(fā)現(xiàn)高山貧營養(yǎng)湖泊水體中，季節(jié)變化引起的AOA的amoA基因組成與16S rRNA基因序列有很好的相關(guān)性，表明湖泊中大部分泉古菌都具有氨氧化能力，且季節(jié)變化引起氨氧化過程中反應(yīng)物(銨)和產(chǎn)物(硝酸鹽)的變化，從而導(dǎo)致AOA相對豐度和多樣性的變化。

3.3 湖泊沉積物中氨氧化古菌

2009年，Ye等[55]對太湖沉積物AOA進(jìn)行分層研究發(fā)現(xiàn)，不同深度的AOA的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，群落多樣性變化尤其大，而相對豐度變化不大，且沉積物好氧層AOA相對豐度小于AOB，而厭氧層AOA相對豐度大于AOB。研究還發(fā)現(xiàn)AOA是湖泊沉積物環(huán)境中硝化作用的主要承擔(dān)者。然而，2010年Liu等[56]對太湖沉積物進(jìn)行分層研究發(fā)現(xiàn)，AOA的相對豐度隨深度增加而增大。

2010年，Wu等[47]應(yīng)用分子生物學(xué)方法對太湖AOA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同采樣點(diǎn)AOA的群落組成和相對豐度是變化的，AOA豐度與有機(jī)質(zhì)累積呈負(fù)相關(guān)，而與水生植物類型無關(guān)。其研究還發(fā)現(xiàn)除東太湖灣外的大部分采樣點(diǎn)AOA的amoA基因數(shù)量遠(yuǎn)大于AOB，這主要是由于東太湖灣水產(chǎn)養(yǎng)殖密集，有機(jī)質(zhì)累積程度高，使得AOA相對豐度較高，同時發(fā)現(xiàn)東太湖灣存在許多獨(dú)特的AOA群落。

同年，向燕[48]研究發(fā)現(xiàn)，太湖竺山灣沉積物中AOA多樣性較高、群落組成相對復(fù)雜，AOA群落結(jié)構(gòu)隨著沉積物深度變化差異不大；藍(lán)藻水華疊加后，AOA在數(shù)量上占明顯優(yōu)勢，且隨著沉積物深度變化，AOA群落結(jié)構(gòu)有明顯差異。隨后又對茭草、苦草和金魚藻三種水生植物進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，研究其根際對AOA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茭草和苦草根際的AOA群落隨植入時間的延長會發(fā)生顯著變化，而金魚藻對AOA的影響較小。

4 結(jié)語

AOA廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中，且在數(shù)量上較AOB占明顯優(yōu)勢，在全球氮循環(huán)中起重要作用。相對而言，土壤和海洋生態(tài)系統(tǒng)中AOA的研究較為充分，而僅有少數(shù)研究涉及湖泊生態(tài)系統(tǒng)。AOA系統(tǒng)發(fā)育研究表明，湖泊生態(tài)系統(tǒng)中AOA的amoA基因序列大都屬于Group 1.1b和Group 1.1a兩個分支。AOA在湖泊水體和沉積物中都被發(fā)現(xiàn)，且通常在數(shù)量上占優(yōu)勢，研究表明，其影響因子主要有水深或沉積物深度、氧濃度、季節(jié)變化、水生植物根際、富營養(yǎng)化程度、有機(jī)質(zhì)累積程度等。

但目前的研究缺乏AOA的活性信息，還不能定量評價它們對氨氧化作用的相對貢獻(xiàn)。這就需要在今后的研究中綜合運(yùn)用生物、化學(xué)的方法，特別是基于功能基因RNA分析和同位素示蹤等技術(shù)，對AOA生態(tài)學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步深入探究。

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