GC法同時測定牽牛子脂肪油中5種脂肪酸

范鑫歆， 畢開順， 馬 超， 魯雪峰， 陳曉輝

(沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016)

牽牛子為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitis nil(L.)Choisy或圓葉牽牛 P.purpurea(L.)Voigt的干燥成熟種子，收載于2010版《中國藥典》。具有瀉水通便，消痰滌飲，殺蟲攻積等作用。用于水腫漲滿、二便不通、痰飲積聚、氣逆喘咳和蟲積腹痛等［1］。牽牛子脂肪油為淡黃色或黃色的澄明油狀液體，味淡，無臭，為牽牛子中有效成分，含有量較大。近年來，僅有氣-質聯(lián)用法對牽牛子脂肪油中成分進行鑒定的報道［2］，但未見對其成分進行定量測定的報道。本實驗對牽牛子脂肪油中5種脂肪酸測定方法進行了研究［3-10］，以期為控制牽牛子脂肪油的質量提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent 6890A毛細管氣相色譜儀，Agilent 2000色譜工作站，氫火焰離子化檢測器(FID)，AGBP210S電子分析天平(Sartorius公司)。棕櫚酸甲酯(批號:18824)、硬脂酸甲酯(批號:13450)、油酸甲酯(批號:18834)、亞油酸甲酯(批號:20040)、亞麻酸甲酯(批號:20196)、豆蔻酸甲酯(批號:14337)均由北京百靈威化學試劑有限公司提供，純度均大于99%。石油醚、正己烷和無水硫酸鈉等均為分析純，購自天津大茂化學試劑廠。牽牛子藥材共10批，產地分別為浙江，江蘇，上海，黑龍江，河北，遼寧，四川，吉林，天津，山東等，經沈陽藥科大學孫啟時教授鑒定為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitis nil(L.)Choisy的干燥成熟種子。

2 方法與結果

2.1 脂肪油的提取 將不同產地的樣品粉碎，過40目篩，取約10 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，加入石油醚70 mL，回流提取10 h，濾過，減壓回收石油醚得總脂肪油。計算得油率，結果浙江，江蘇，上海，黑龍江，河北，遼寧，四川，吉林，天津，山東分別為 6.7%，20%，16.7%，17.0%，15.6%，9.5%，10.5%，13.3%，15.6%，12.9%。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取對照品棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，制成質量濃度分別為 5.95、5.52、5.48、6.44、4.52 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯對照品溶液 3、1、2、4、0.4 mL 置同一 25 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到混合對照品溶液。

2.2.2 內標溶液 精密稱取豆蔻酸甲酯適量，置25 mL量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為0.52 mg/mL的內標溶液。

2.2.3 供試品溶液 取脂肪油約100 mg，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，加入0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液5 mL，置60℃水浴回流皂化30 min，至油珠全部消失，放冷，加15%三氟化硼乙醚的甲醇溶液2 mL，置60℃水浴酯化5 min，放冷，精密加入正己烷5 mL，超聲2 min，取出，置于分液漏斗中，加飽和氯化鈉溶液10 mL，振搖，靜置，取上層溶液，加無水硫酸鈉干燥，再精密量取干燥后的溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入內標溶液0.5 mL，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 DB-Wax毛細管柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);氫火焰離子化檢測器(FID);進樣口溫度230℃;檢測器溫度250℃;柱溫以170℃為起始溫度，以10℃/min升至230 ℃，保持5 min;載氣N2，體積流量1.0 mL/min;進樣方式為分流進樣，分流比15∶1;進樣量1 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數按亞油酸計算大于1.0×105，各峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，各峰拖尾因子均在0.95～1.05之間。對照品和樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)and sample(B)

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL 置10 mL 量瓶中，分別精密加入內標溶液0.5 mL，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下測定。以各對照品溶液質量濃度(X，mg/mL)為橫坐標，以對照品與內標峰面積的比值(Y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。棕櫚酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯回歸曲線方程分別為:Y=26.87X+1.830 ×10－2，r=0.9996;Y=21.98X+8.60 × 10－3，r=0.9996;Y=24.64X+2.030 × 10－2，r=0.9998;Y=22.86X+3.260 × 10－2，r=0.9997;Y=23.54X+5.200 ×10－3，r=0.9994。棕櫚酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯分別在0.04～0.57 mg/mL，0.01 ～ 0.18 mg/mL，0.02 ～ 0.35 mg/mL，0.05 ～0.82 mg/mL，0.004 ～ 0.06 mg/mL 范圍內，與內標峰面積比值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗 取混合對照品溶液在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，以棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯與內標峰面積比值計算 RSD，結果分別為 0.9%，1.1%，1.4%，1.0%，1.5%。

2.6 重復性試驗 取同一批號藥材(江蘇)6份，按2.1項及2.2.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸含量的 RSD 分別為 1.3%，1.6%，1.5%，1.6%，2.0%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫放置，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 分別進樣分析，計算棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯各時間點峰面積與內標峰面積比值的RSD分別為 1.0%，1.4%，1.5%，1.2%，1.9%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗 稱取已知量的同一批號牽牛子脂肪油(江蘇)約50 mg，共9份，按低、中、高濃度分別加入各對照品貯備液，每一濃度3份。按照2.2.3項下方法操作制備供試溶液，在上述色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表1。

2.9 樣品測定 取不同產地牽牛子脂肪油約100 mg，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，并在上述色譜條件下測定，按內標法計算，結果見表2。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 本研究考察了 DB-17，DBWax 3種不同型號的石英毛細管柱，結果表明DBWax石英毛細管柱能夠使待測脂肪酸組分具有良好的分離和合適的保留時間。

表1 回收率試驗結果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 牽牛子油測定結果(n=3)Tab.2 Determination results of fatty acid in seed of Pharbitis nil(L.)Choisy

3.2 柱溫的考察 曾嘗試200℃恒溫測定，結果分析時間較長，且拖尾嚴重。嘗試170～230℃程序升溫的方式，色譜峰分離度好，且峰型良好，因此確定程序升溫條件為初始溫度170℃，以10℃/min升溫，升至230℃。

3.3 提取方法的考察 研究中以石油醚(60～90℃)為提取溶劑，對索氏提取8 h和回流提取8 h，分別進行了考察，結果證明兩種方法的提取率差別不大，因此選用較為方便的回流提取法。在此基礎上對不同的提取時間(6，8，10，12 h)進行了考察，結果表明提取10 h與提取12 h牽牛子脂肪油的提取率基本一致，故確定提取時間為10 h。

本實驗對10批樣品測定的結果表明，不同產地的牽牛子脂肪油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸各成分質量分數最低和最高相差5倍左右，這可能與生長環(huán)境、干燥方法和貯存時間不同有關。測定結果表明牽牛子脂肪油中亞油酸量最高，占總油的34.6%，亞油酸具有降低血液中膽固醇的濃度，減少膽固醇在血管壁沉積的生理活性［11-13］。因此，牽牛子脂肪油的藥用資源有待于進一步的開發(fā)與利用，本研究為牽牛子脂肪油的進一步臨床應用價值和質量控制提供了依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:177.

［2］李澎灝，陳振德.牽牛子脂肪油超臨界CO2萃取及氣相-質譜測定［J］.中國藥房，2003，14(7):431.

［3］于雙慧，陳曉輝，畢開順.GC法測定蓽澄茄中棕櫚酸、油酸與亞油酸的含量［J］.藥物分析雜志.2008，28(9):1485-1488.

［4］原思通，張保獻，黃紅生.氣質聯(lián)用法分析炮制對芫花揮發(fā)油的影響［J］.中國中藥雜志.1993，18(10):595-598.

［5］田連起，石延榜，張本山，等.黑丑與白丑炒制前后藥學初步研究［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2010，8(6):157.

［6］陳立娜，李 萍，張重義，等.牽牛子脂肪油類成分分析［J］.中草藥，2003，34(11):983-984.

［7］李澎灝，陳振德.牽牛子脂肪油超臨界CO2萃取及氣相-質譜測定［J］.中國藥房，2003，14(7):431-432.

［8］林文群，陳 忠，劉劍秋.牽牛子(黑丑)化學成分的初步研究［J］.福建師范大學學報自然學版，2002，18(2):61-64.

［9］鄭虎占.中藥現(xiàn)代研究與應用［M］.北京:學苑出版社，1998:3274-3279.

［10］劉春生，馬澤新，常立軍.黑丑和白丑的考證［J］.中藥材，1995，18(8):420-421.

［11］Elias P M，Brown B E，Ziboh V A.The permeability barrier in essential fatty acid deficiency:evidence for a direct role for linoleic acid in barrier function［J］.J Invest Dermatol，1980，74:230.

［12］陳銀基，鞠興榮，周光宏.飽和脂肪酸分類與生理功能［J］.中國油脂，2008，33(3):35-39.

［13］陳銀基，周光宏，徐幸蓮.n-3多不飽和脂肪酸對疾病的預防與治療作用［J］.中國油脂，2006，31(9):31-34.