1HNMR研究苯甲酸鈉、維生素C及葡萄糖與蛋白質的結合部位

李 磊，劉雪鋒，阮小云，趙英杰

(1.中國石油集團石油職業(yè)衛(wèi)生技術服務中心，河北 廊坊 065000；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；3.廊坊師范學院管理學院，河北 廊坊 065000)

選取典型防腐劑、維生素以及葡萄糖，開展與生物體重要運輸?shù)鞍缀拖赶嗷プ饔醚芯浚梢詮姆肿訉用嫣峁┥戆踩确矫娴闹匾畔1，2]。苯甲酸鈉(Sodium benzoate，SB)(圖1A)是最常用的食品、藥物防腐劑。維生素C(Vitamin C，VC)(圖1B)是人體必需的重要維生素，是食品、飲料等常用營養(yǎng)添加劑之一。葡萄糖(Glucose，Glu)(圖1C)是生物體必需的基礎營養(yǎng)和能源物質，是食品和醫(yī)藥行業(yè)的重要基礎原料。血清白蛋白是生物體血漿中含量最豐富的蛋白質，能與許多內(nèi)源和外源物質可逆結合[3，4]，是最重要的運輸?shù)鞍祝晃傅鞍酌?Pepsin)是胃液中最重要的消化蛋白酶。SB與牛血清白蛋白(BSA)之間的結合已有報道[5]，但具體結合部位不明確；尚未見到SB與Pepsin以及VC、葡萄糖與BSA、Pepsin結合部位的相關報道。

作者采用核磁共振(1HNMR)波譜技術研究了SB、VC、葡萄糖分別與BSA和Pepsin相互結合的主要部位，對分子間的作用方式進行了理論推測。

圖1 苯甲酸鈉(A)、VC(B)和葡萄糖(C)的分子結構

1 實驗

1.1 試劑和儀器

牛血清白蛋白(>98%，BSA FractionⅤ)，上海華美生物工程公司；胃蛋白酶(生化試劑)、苯甲酸鈉(分析純)、L(+)維生素C(分析純)、α-D-葡萄糖(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；重水(分析純)，北京化學試劑公司。

ARX-300型核磁共振儀，瑞士Bruker公司。

1.2 方法

20℃時以D2O為溶劑，首先測定小分子物質的1HNMR譜，然后加入一定量的蛋白質，測定小分子物質-蛋白質溶液的1HNMR譜，以D2O(化學位移δ=4.70 ppm)為內(nèi)標確定各H原子化學位移。

2 結果與討論

2.1 苯甲酸鈉與蛋白質的結合部位

圖2為SB、SB-BSA和SB-Pepsin的1HNMR譜，其中SB-Pepsin1HNMR譜中未標出的信號為Pepsin的1HNMR信號，譜圖解析結果列于表1。

圖2 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的1HNMR圖譜

表1 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的化學位移值δ及改變量Δδ

由表1可見，分別加入BSA和Pepsin后，SB各H原子化學位移均略向低場移動，表明SB與BSA和Pepsin能夠互相結合[6]。這種結合屬于非化學鍵物理結合，因此，SB分子中各H化學位移改變幅度不大；此外，由于SB為水溶性物質，因此在蛋白質分子中SB的結合部位不可能是蛋白質分子的疏水空腔區(qū)域，而應該在臨近蛋白質分子表面的親水區(qū)域層。結合在蛋白質親水區(qū)域層的SB分子的羧酸陰離子應該與蛋白質的親水陽離子之間存在靜電相互作用，盡管1HNMR結果難以給出靜電相互作用的證據(jù)，但從理論上推測，SB與蛋白質分子間的靜電相互作用是可能的。1HNMR結果顯示SB分子中苯環(huán)上H原子化學位移均向低場移動，說明SB與蛋白質結合的主要部位為SB分子的苯環(huán)片段[6]。SB與BSA和Pepsin結合后，水對SB溶劑化作用有所減弱，從而使SB苯環(huán)上電子云密度略微降低，SB苯環(huán)H化學位移應該向低場移動；同時，SB與蛋白質分子結合后，SB的苯環(huán)能夠與BSA和Pepsin的芳香性氨基酸殘基的芳香環(huán)之間發(fā)生π-π電子堆積作用[7]，環(huán)電流對SB苯環(huán)上的H原子去屏蔽效應增強，SB苯環(huán)H化學位移向低場移動[8]。

需要指出的是，與Pepsin結合后SB苯環(huán)H原子化學位移改變幅度相對較大，其原因可能是BSA和Pepsin分子結構存在明顯差異。BSA分子中α-螺旋結構含量比Pepsin多，而β-折疊、Turn結構含量相對較少[9～11]，因此，BSA分子結構相對規(guī)整且緊密，而Pepsin分子結構較松散，導致SB苯環(huán)更加接近Pepsin芳香性氨基酸殘基的芳香環(huán)，兩者之間的π-π作用更強。

2.2 VC與蛋白質的結合部位

圖3為VC、VC-BSA和VC-Pepsin的1HNMR譜，譜圖解析結果列于表2。

圖3 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的1HNMR圖譜

表2 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的化學位移值δ及改變量Δδ

由表2可見，分別加入BSA和Pepsin后，VC分子中乙二醇支鏈片段H原子化學位移均向低場方向移動，說明VC與BSA和Pepsin的結合部位是VC分子中乙二醇支鏈片段。VC為非電解質，分子結構中富含高電負性O原子，因此，從理論上推斷VC分子與BSA、Pepsin之間應該存在分子間氫鍵作用。VC分子與BSA和Pepsin分子結合后，VC-Ha、VC-Hb、VC-Hc和VC-Hd與溶劑水之間的分子間氫鍵數(shù)目減少，H原子周圍電子云密度降低，去屏蔽效應增強，其化學位移向低場方向移動，屬于熱力學熵驅動過程。與SB的結合情況類似，與Pepsin結合后VC分子中乙二醇支鏈片段H原子化學位移改變幅度相對較大，這可能也是BSA和Pepsin分子結構差異所導致的。

2.3 葡萄糖與蛋白質的結合部位

圖4為Glu、Glu-BSA和Glu-Pepsin的1HNMR譜，譜圖解析結果列于表3。

圖4 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的1HNMR圖譜

表3 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的化學位移值δ及改變量Δδ

由表3可見，葡萄糖分子H原子的化學位移在分別加入BSA和Pepsin后均向低場方向移動，說明葡萄糖是以整個分子與BSA、Pepsin互相結合。葡萄糖是多羥基非電解質，與VC類似，葡萄糖的-OH也應該與BSA、Pepsin分子間存在分子間氫鍵作用。但是與BSA、Pepsin結合后，葡萄糖與溶劑水分子間氫鍵數(shù)目減少，使葡萄糖分子中Glu-Ha和Glu-Hb原子周圍電子云密度降低，去屏蔽效應增強，其化學位移向低場方向移動。與Pepsin結合后，Glu-Ha化學位移改變幅度相對較大，其原因與SB、VC相類似；但Glu-Hb化學位移改變幅度反而減弱，這可能是由于Pepsin分子肽鏈比BSA短，不足以有效包裹葡萄糖分子，即與Pepsin結合時葡萄糖Glu-Hb部分暴露于水相。

3 結論

SB與BSA、Pepsin的結合部位為SB分子中的苯環(huán)片段，除靜電相互作用外，主要以芳香環(huán)間π-π電子堆積作用方式相互結合。VC與BSA、Pepsin的結合部位為VC分子結構的乙二醇支鏈片段，而葡萄糖則以整個分子與BSA、Pepsin結合；VC、葡萄糖主要以分子間氫鍵方式與BSA、Pepsin結合。3種物質分子與BSA和Pepsin結合部位H原子的化學位移改變幅度不大，推測3種物質分子在蛋白質分子上的結合部位可能處于臨近蛋白質分子表面的親水區(qū)域層。

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