赤蘚糖醇產(chǎn)生菌誘變育種新途徑

賈豐彬，陳建華

(中國藥科大學(xué)分子生物學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

赤蘚糖醇(Erythritol)化學(xué)名稱為1，2，3，4-丁四醇，廣泛存在于水果、發(fā)酵食品中，甜度為蔗糖的70%～80%。能被小腸快速吸收，但90%沒有進(jìn)行代謝而排出體外，是在自然界中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量最小的糖醇，不僅擁有糖醇類產(chǎn)品所有的卓越功能，如防齲齒、適于糖尿病患者食用，還獨具熱量極低(≤1.66 kJ·g-1)和耐受量高(無副作用)的特性。赤蘚糖醇具有良好的食品加工適應(yīng)性和生理保健功能，作為一種新型功能性保健食品原料被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品及化工等領(lǐng)域[1]。

赤蘚糖醇工業(yè)上主要是用耐高滲酵母或其它主產(chǎn)赤蘚糖醇的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，選擇適宜的育種方法、選育赤蘚糖醇優(yōu)產(chǎn)菌株是生產(chǎn)的關(guān)鍵。據(jù)文獻(xiàn)報道[2]，1950年Binkey和Wolform首次提出酵母菌可以產(chǎn)生赤蘚糖醇。其后國內(nèi)外學(xué)者就產(chǎn)赤蘚糖醇菌株篩選進(jìn)行了大量研究。范光先等[3]篩選出一株單產(chǎn)赤蘚糖醇的球狀酵母OS-194，Marimuthu等[4]從污泥中篩選得到一株耐高滲酵母P.tsukubaensisKN75，吳燕等[5]篩選得到一株圓酵母Torulasp.，Lin等[6]從蜂蜜中篩選出一株菌Moniliellasp.440，以上菌株均是通過葡萄糖高滲法從自然界直接分離得到的。

作者通過對產(chǎn)甘油耐高滲酵母進(jìn)行紫外誘變處理產(chǎn)赤蘚糖醇，為赤蘚糖醇產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)量提高提供了一條新的途徑。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

菌種：從自然界分離的產(chǎn)甘油耐高滲酵母CF4。

葡萄糖、濃硫酸，南京化學(xué)試劑有限公司；酵母膏，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈，汕頭市西隴化工廠有限公司。以上試劑均為分析純。

722型可見分光光度計，上海天普儀器有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，瓊脂2%，pH值5～6。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20%，酵母膏1%，尿素0.5%，pH值5～6。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，pH值5～6。

1.3 方法

1.3.1 菌株CF4生長曲線的測定

自新鮮的CF4斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)接種到液體種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 h取樣，離心，棄上清，收集菌體，將菌體重懸于蒸餾水中，反復(fù)2次，測定菌體密度OD600，以蒸餾水作為空白對照，繪制菌株CF4的生長曲線。

1.3.2 菌懸液的制備[7]

自新鮮的CF4斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)接種到盛有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)10～18 h。取5 mL種子液，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，菌體用生理鹽水洗滌2次，重懸于5 mL生理鹽水中制成菌懸液。

1.3.3 紫外誘變處理

開啟20 W紫外燈，預(yù)熱30 min，使波長穩(wěn)定。將4 mL出發(fā)菌株的菌懸液分散于滅菌的培養(yǎng)皿中，在距紫外燈25 cm處，照射60 s、90 s、180 s、270 s、360 s，處理后的菌懸液被稀釋至1×10-6。吸取0.2 mL稀釋菌懸液涂布于含有培養(yǎng)基的平皿中，30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。

1.3.4 突變菌株的篩選

待單菌落長出后，挑取菌落大、厚實的菌株分別接種到斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h后，接種于30 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)3 d，用薄層層析和高效液相色譜定性，篩選出產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株，然后按接種量8%移種于50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min-1培養(yǎng)5 d，用高效液相色譜測定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，確定優(yōu)勢菌株。

1.4 分析測試

1.4.1 發(fā)酵液中赤蘚糖醇和葡萄糖定性分析(薄層層析法)[8]

用毛細(xì)管分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在制好的薄層板上點樣，放在正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5的展開劑中上行4～5 h后顯色，顯色劑為高碘酸鈉-聯(lián)苯胺溶劑，將薄層板從展開缸中取出，烘干，浸入高碘酸鈉溶液中，取出后再浸入聯(lián)苯胺溶液中，烘干，觀察薄層板上變化。

1.4.2 發(fā)酵液中赤蘚糖醇含量測定(高效液相色譜法)[9]

色譜條件：色譜柱為Lichrospher 5-NH2(4.6 mm× 250 mm)；柱溫30℃；流動相為乙腈-水(80∶10，體積比)；流速1.0 mL·min-1；示差折光檢測器，檢測器溫度為35℃。

測定方法：精密稱取赤蘚糖醇對照品0.5 g定容于10 mL容量瓶中，用流動相制成50.00 g·L-1的儲備液，再將其稀釋為0.50 g·L-1、1.00 g·L-1、2.00 g·L-1、4.00 g·L-1、6.00 g·L-1、8.00 g·L-1和10.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每一濃度分別進(jìn)樣10 μL，測定3次，取峰面積平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 紫外誘變處理后致死率的測定[10]

采用平板計數(shù)法測定致死率：將紫外誘變處理前、后的菌液分別用生理鹽水稀釋至1×10-6，各吸取0.2 mL涂布于含有培養(yǎng)基的平皿中，以未處理的菌液作對照，30℃培養(yǎng)48 h，單菌落計數(shù)，計算致死率。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵液中赤蘚糖醇和葡萄糖定性分析結(jié)果

2.1.1 薄層層析分析(圖1)

1.甘油標(biāo)準(zhǔn)品 2.混合標(biāo)準(zhǔn)品，自上而下為赤蘚糖醇、葡萄糖 3～6.CF4發(fā)酵液 7.UV3-CF4-5 8.UV4-CF4-3 9.混合標(biāo)準(zhǔn)品，自上而下分別為甘油、赤蘚糖醇 10.UV3-CF4-1 11.UV3-CF4-3

對發(fā)酵液進(jìn)行薄層層析分析，薄層板上出現(xiàn)了白色斑點。由圖1可知，菌株CF4只產(chǎn)生甘油，經(jīng)紫外誘變后，有赤蘚糖醇產(chǎn)生。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與菌株CF4誘變前后發(fā)酵液的高效液相色譜圖(圖2、圖3)

圖2 甘油標(biāo)準(zhǔn)品(A)和菌株CF4誘變前發(fā)酵液(B)的高效液相色譜圖

圖3 赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(C)和誘變菌株UV3-CF4-5發(fā)酵液(D)的高效液相色譜圖

由圖2可知，甘油的保留時間為7.10 min左右，菌株CF4誘變前只產(chǎn)甘油，與薄層層析結(jié)果一致。

由圖3可知，赤蘚糖醇保留時間為8.77 min左右，紫外誘變菌株UV3-CF4-5只產(chǎn)赤蘚糖醇，與薄層層析結(jié)果一致。

2.2 菌株CF4的生長曲線(圖4)

圖4 菌株CF4的生長曲線

由圖4可以看出，培養(yǎng)2～8 h期間菌體數(shù)量變化不明顯，為延滯期；10 h后菌體數(shù)量迅速增加，進(jìn)入生長期；20 h后菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，即進(jìn)入穩(wěn)定期，可見該菌株的對數(shù)生長期在10～20 h之間。因此，選取培養(yǎng)時間為16 h的菌株進(jìn)行紫外誘變。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以赤蘚糖醇濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。擬合得回歸方程y=75791x+18334，R2=0.999，赤蘚糖醇濃度范圍為0.5～10 g·L-1時，線性相關(guān)較好。

圖5 赤蘚糖醇濃度與峰面積的關(guān)系曲線

2.4 紫外誘變時間的確定(圖6)

圖6 紫外誘變時間對致死率的影響

由圖6可知，紫外誘變270 s時，致死率達(dá)85%以上，因此，確定紫外誘變時間為270 s。

2.5 菌株紫外誘變結(jié)果

菌株CF4經(jīng)過紫外誘變處理，在平皿上長出較大、厚實的單菌落共36株，其中獲得了6株產(chǎn)赤蘚糖醇菌株，命名為UV4-CF4-3、UV3-CF4-1、UV3-CF4-5、UV3-CF4-4、UV3-CF4-3、UV3-CF4-6，挑取接種到斜面上，再分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d，測定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，結(jié)果見表1。

表1 菌株CF4紫外誘變結(jié)果

由表1可以看出，菌株UV3-CF4-5赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為25.68 g·L-1，因而選擇UV3-CF4-5作為優(yōu)勢菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.6 菌株穩(wěn)定性實驗

將UV3-CF4-5進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測定赤蘚糖醇的產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 UV3-CF4-5的遺傳穩(wěn)定性

由表2可知，UV3-CF4-5經(jīng)過5次傳代，赤蘚糖醇產(chǎn)量比較穩(wěn)定，說明該菌株產(chǎn)赤蘚糖醇有較好的穩(wěn)定性。

2.7 討論

目前，赤蘚糖醇產(chǎn)生菌主要是通過耐高滲法從自然界分離，而自然界篩選出的耐高滲菌株大多數(shù)產(chǎn)甘油，單產(chǎn)赤蘚糖醇菌株較少并很難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，這樣極大地限制了高產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的分離。

在酵母菌代謝過程中，葡萄糖通過糖酵解和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生大量的還原能，從而導(dǎo)致多種多元醇的生成。赤蘚糖醇主要是通過磷酸戊糖途徑合成的，葡萄糖通過磷酸戊糖途徑在4-磷酸赤蘚糖脫氫酶作用下生成4-磷酸赤蘚糖，4-磷酸赤蘚糖在赤蘚糖-4-磷酸激酶作用下生成赤蘚糖，然后在赤蘚糖還原酶作用下生成赤蘚糖醇。甘油是在糖酵解過程中產(chǎn)生的，葡萄糖通過糖酵解，在一系列酶的作用下生成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛氧化生成3-磷酸甘油酸的過程中產(chǎn)生甘油[11]。本實驗對甘油產(chǎn)生菌進(jìn)行紫外誘變，可能阻斷了糖酵解的過程，而使葡萄糖降解主要通過磷酸戊糖途徑進(jìn)行，生成赤蘚糖醇，具體阻斷機制需要進(jìn)一步研究證明。

3 結(jié)論

(1)通過對產(chǎn)甘油菌株CF4進(jìn)行紫外誘變處理，獲得了6株產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株，其中菌株UV3-CF4-5產(chǎn)量最高，為25.68 g·L-1，效果比較顯著，為產(chǎn)赤蘚糖醇菌株的篩選提供了一條新的途徑。

(2)研究了菌株UV3-CF4-5的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明，經(jīng)過多次傳代，菌株UV3-CF4-5產(chǎn)赤蘚糖醇的能力沒有改變，表明其是穩(wěn)定的變異株。

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