深海微生物絮凝劑HBF-3的劑型研究

趙 妮，印 文，王階平，邵宗澤，喻子牛，何 進(jìn)

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361000)

傳統(tǒng)絮凝劑包括無機(jī)絮凝劑和有機(jī)高分子絮凝劑兩類[1，2]，雖然絮凝性能優(yōu)良，但用量大、費(fèi)用高、會(huì)產(chǎn)生二次污染[3]。微生物絮凝劑(Microbial flocculant，MBF)與傳統(tǒng)絮凝劑相比，具有無毒無害、安全性高；可利用生物技術(shù)，通過微生物發(fā)酵、分離提取而大規(guī)模生產(chǎn)，因而成本低；產(chǎn)生菌易得，來源豐富，生產(chǎn)周期短且效率高；易被微生物降解，無二次污染；很強(qiáng)的除濁和脫色性能；pH值和熱穩(wěn)定性強(qiáng)、用量小等特點(diǎn)[4，5]。已成為凈水領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

微生物絮凝劑HBF-3是深海鹽單胞菌Halomonassp.V3a′ 分泌的相對(duì)分子質(zhì)量約為2.3×105的胞外多糖，總糖含量為28.9%，其中，中性糖20.6%、糖醛酸7.2%、氨基糖1.1%[6]。在50 L發(fā)酵罐的中試生產(chǎn)中，HBF-3的產(chǎn)量可達(dá)5.4 g·L-1[7]。HBF-3具有絮凝活性高、作用譜廣和用量少等特點(diǎn)，因而具有很大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景[6，8]。作者在此采用冷凍干燥技術(shù)將發(fā)酵液制成固體劑型以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮技術(shù)將發(fā)酵液制成液體劑型對(duì)微生物絮凝劑HBF-3的劑型進(jìn)行研究，并添加合適的防腐劑，考察其絮凝活性，測(cè)試其保質(zhì)期，擬為延長(zhǎng)運(yùn)輸及貨架保存期提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

Halomonassp.V3a′是由國(guó)家海洋局第三海洋研究所從西太平洋深海沉積物中分離得到的鹽單胞菌Halomonassp.V3a經(jīng)誘變獲得的高產(chǎn)絮凝劑菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10.0，NH4Cl 1.0，KH2PO42.0，K2HPO45.0，酵母膏0.6，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH值7.5。

1.2 方法

1.2.1 絮凝劑HBF-3的發(fā)酵生產(chǎn)

種子培養(yǎng)：將活化后的菌種接種至培養(yǎng)基，于28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

搖瓶發(fā)酵：按3%的接種量將種子液接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)48 h，然后在常溫下靜置培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r·min-1離心30 min，上清液即為絮凝劑HBF-3。

1.2.2 固體劑型的絮凝活性的測(cè)定

取發(fā)酵液上清，先在-40 ℃下預(yù)凍90 min，然后再于100 mt、-40 ℃冷凍干燥，即得到固體劑型的絮凝劑HBF-3。凍干的HBF-3復(fù)溶于水至凍干前的體積，參照文獻(xiàn)[7]測(cè)定其絮凝活性。

1.2.3 液體劑型的絮凝活性的測(cè)定

取發(fā)酵液上清，在壓力為-0.097 MPa、溫度為50 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，直至體積為原發(fā)酵液的1/5，即得到液體劑型的絮凝劑HBF-3。HBF-3濃縮液經(jīng)5倍稀釋后，參照文獻(xiàn)[7]測(cè)定其絮凝活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 固體劑型HBF-3的絮凝活性

冷凍干燥能夠維持絮凝劑的原有形狀，使之不易干裂、收縮和硬化，最大限度地保持絮凝活性；同時(shí)，產(chǎn)品含水量低，易于運(yùn)輸與貯藏，而且可延長(zhǎng)保質(zhì)期[9]。保護(hù)劑在冷凍干燥過程中能起到抗冷凍作用，使干燥過程較容易進(jìn)行；同時(shí)也是一個(gè)很好的穩(wěn)定基質(zhì)，使再水化過程變得容易[10]。不同種類的保護(hù)劑對(duì)固體劑型HBF-3的絮凝活性的影響見表1。

表1 保護(hù)劑對(duì)固體劑型HBF-3絮凝活性的影響

由表1可知，添加5%蔗糖、5%蔗糖+5%甘露醇、10%脫脂奶粉+0.5%抗壞血酸+5%蔗糖保護(hù)劑，固體劑型HBF-3復(fù)溶后的絮凝活性均達(dá)到82%以上。這是因?yàn)?，蔗糖具有很?qiáng)的水化能力，能在絮凝劑表面形成穩(wěn)定的水化保護(hù)層[11]?？紤]到生產(chǎn)成本，以5%蔗糖為保護(hù)劑最為可行，而且凍干的HBF-3能夠迅速復(fù)溶于水，有利于后續(xù)的使用。

2.2 液體劑型HBF-3的絮凝活性

在一定壓強(qiáng)下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的速率與溫度和轉(zhuǎn)速相關(guān)。轉(zhuǎn)速大可使內(nèi)部水分及時(shí)翻動(dòng)到表面，增大了蒸發(fā)面積，從而加快蒸發(fā)速率[12]；但轉(zhuǎn)速越大，越容易起泡，不易控制。溫度過低，蒸發(fā)速率變慢；而溫度過高，對(duì)HBF-3絮凝活性會(huì)有影響。此外，隨著蒸發(fā)進(jìn)行，濃度、粘度、水分遷移阻力相繼增大，蒸發(fā)速率逐漸趨緩。

經(jīng)多次優(yōu)化，確定液體劑型HBF-3的最優(yōu)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮條件為：壓力-0.097 MPa，溫度50 ℃。將連續(xù)2次發(fā)酵得到的發(fā)酵液分別進(jìn)行濃縮，濃縮前第一批上清活性為98.0%、第二批上清活性為97.4%，2批發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/5后，HBF-3濃縮液稀釋5倍后的絮凝活性分別為96.8%和94.3%。說明旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮處理對(duì)HBF-3的絮凝活性影響不大。

2.3 防腐儲(chǔ)存

在液體劑型HBF-3中添加防腐劑于4 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后，稀釋至原始濃度后測(cè)得的絮凝活性見表2。

表2 液體劑型HBF-3添加防腐劑在4 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后的絮凝活性

由表2可知，儲(chǔ)存一個(gè)月后未添加防腐劑的HBF-3的絮凝活性有所下降，而添加防腐劑(無論是單一的還是組合的)，可以不同程度地保持HBF-3的絮凝活性。研究表明，HBF-3分子鏈中的活性基團(tuán)和大分子的吸附架橋作用是促進(jìn)膠體物質(zhì)絮凝沉淀的最主要的作用力[13]，靜置后絮凝活性的提高可能是防腐劑本身的基團(tuán)促進(jìn)了吸附架橋作用。

表3為第一批HBF-3濃縮液添加防腐劑后于不同溫度儲(chǔ)存一個(gè)月后的絮凝活性。

表3 液體劑型HBF-3添加防腐劑后在不同溫度下儲(chǔ)存一個(gè)月后的絮凝活性

由表3可知，未添加防腐劑的HBF-3濃縮液于4 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后絮凝活性為92.1%，而在28 ℃、37 ℃、50 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后，基本無絮凝活性；添加1.0 g·L-1山梨酸鉀的HBF-3濃縮液在4 ℃、28 ℃、37 ℃、50 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后均能保持90%以上的絮凝活性；在37 ℃以下儲(chǔ)存一個(gè)月，只需要添加0.75 g·L-1山梨酸鉀就可以起到很好的防腐效果。這是因?yàn)?，山梨酸鉀的抑菌效果隨pH值的降低而增強(qiáng)，pH值為3.0時(shí)抑菌效果達(dá)到最佳，而HBF-3濃縮液的pH值正好在3.0左右，因此山梨酸鉀是HBF-3絮凝劑的良好防腐劑。在28 ℃儲(chǔ)存時(shí)，復(fù)合防腐劑0.75 g·L-1山梨酸鉀+0.75 g·L-1雙乙酸鈉較單一防腐劑0.75 g·L-1山梨酸鉀的防腐效果要好。這是因?yàn)?，雙乙酸鈉是霉菌和細(xì)菌的高效抑制劑，尤其是對(duì)黃曲霉毒素有較強(qiáng)的抑制作用[14]，在霉菌和細(xì)菌容易生長(zhǎng)的溫度下添加適量的雙乙酸鈉可以達(dá)到比較好的防腐效果。

本實(shí)驗(yàn)中防腐劑用量均未超出它們?cè)谑称分械南蘖浚虼诉M(jìn)行水處理時(shí)，HBF-3與懸浮物一起沉入水底，不會(huì)影響水質(zhì)。

3 結(jié)論

對(duì)微生物絮凝劑HBF-3的劑型進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，以5%蔗糖為保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥制成固體劑型，凍干的HBF-3復(fù)溶后的絮凝活性為82.4%；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/5制成液體劑型，濃縮液稀釋5倍后的絮凝活性與初始發(fā)酵液相比，變化不大；濃縮液添加1.0 g·L-1山梨酸鉀，在4 ℃、28 ℃、37 ℃、50 ℃儲(chǔ)存一個(gè)月后能夠保持較高的絮凝活性。為HBF-3絮凝劑的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)，也為HBF-3的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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