茯苓多糖的純化及分子量測定

顏 軍，陶 濤，孫曉春，何 鋼，易 勇，茍小軍，

(1.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)重點實驗室，四川 成都 610106；2.四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052)

茯苓(Poriacocos)是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，主產(chǎn)云南(云苓)、安徽(安苓)、貴州、廣西、湖北、福建(閩苓)等地[1]，為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，屬擔子菌綱真菌，具有滲濕、健脾、利尿等功能[2]。

茯苓的主要有效成分為茯苓多糖(Tuckahoe polysaccharide, TAP)，約占茯苓菌核干重的70%～90%[3，4]。茯苓異多糖具有促進細胞分裂、補體激活、誘變、抗腫瘤、抗癌、增強免疫性等生物活性[5～7]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品等領(lǐng)域，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。茯苓多糖結(jié)構(gòu)及生物活性的研究也逐漸得到重視[8，9]。

目前，有對茯苓多糖進行化學(xué)修飾后測定其分子量的報道[10]，而對茯苓多糖純化后進行分子量測定的報道較少。多糖分子量的測定方法有凝膠滲透色譜和光散射聯(lián)用法(GPC-LS)[11]、高效凝膠排阻色譜法[12，13]、手工裝填的凝膠柱色譜法[14]。手工柱色譜法測定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差，造成分子量測定的偏差。作者從茯苓中提取水溶性多糖、去蛋白質(zhì)后用DEAE-650C層析柱進行分離純化，對純化后的茯苓多糖采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行分子量的測定。為深入研究茯苓多糖的生物活性及在食品與醫(yī)療保健中進一步開發(fā)利用提供了可行性依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

白茯苓，購自成都荷花池藥材市場，粉碎，過40目篩。

DEAE-650C層析柱，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。標準系列葡聚糖Dextran (T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000)、葡萄糖、苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇、乙醇等，均為國產(chǎn)分析純。

L-2490型HPLC(RI檢測器)，日本日立；GL-21M 型高速冷凍儀，湘儀；UV/VIS 280PC型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；BS-100A型自動部分收集器、TH-300型梯度混合器、HL-2B型恒流泵，上海青浦滬西儀器廠；電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 茯苓粗多糖的提取[12]

稱取一定量茯苓粉，加入4～6倍量的水，熬煮3次，提取時間分別為3 h、2 h、1 h，過濾，合并3次提取液，減壓濃縮至適量，在攪拌下加入95%的乙醇，使其含醇量達到80%，靜置過夜。析出褐色沉淀后，1000 r·min-1離心10 min，得沉淀，低溫干燥，即得茯苓粗多糖。

1.3 茯苓粗多糖的精制

采用Sevag 法反復(fù)除蛋白。取茯苓粗多糖溶液4 mL，加入氯仿和正丁醇1 mL[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，充分振蕩20 min，離心去除水層與溶劑層交界處的變性蛋白，反復(fù)數(shù)次，直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

1.4 茯苓多糖的純化

將DEAE-650C層析柱水平衡后，取200 mg精制多糖樣品溶解于蒸餾水中上樣，蒸餾水洗脫60 mL后，以0～3 mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，每管收集2 mL，分布收集、備用。硫酸-苯酚法檢測多糖含量。

1.5 多糖含量的測定[15]

硫酸-苯酚顯色液的配制：用50 mL濃硫酸和10 mL水配制實驗用硫酸溶液，并加入0.6 g苯酚，配制成顯色液。

顯色方法：移取1.00 mL待測樣品于試管中，加入5.00 mL顯色液，振蕩混勻。置于沸水浴中保溫30 min，立即置于冷水浴中，冷卻至室溫。以未加葡萄糖溶液作為空白對照。于490 nm處測定系列葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。測定樣品溶液490 nm處吸光度，據(jù)標準曲線計算多糖含量。

1.6 分子量的測定

采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進行分子量的測定。

色譜條件：色譜柱：YMC Pack-Diol 200柱(300 mm×8.0 mm，S-5 μm，20 nm)；流動相：蒸餾水；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測器：示差折光檢測器；進樣量：20 μL。

標準曲線的繪制：以系列葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000和葡萄糖為標準品，分別用流動相溶解配制成2 mg·mL-1溶液進樣，記錄洗脫峰的保留時間。分子量Mw與其在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數(shù)Kav存在如下關(guān)系：

Ve=a-blgMw

Kav=K1-K2lgMw

Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)

式中：a、b、K1、K2為常數(shù)；V0為T-2000的洗脫體積；Vt為葡萄糖的洗脫體積，均以保留時間表示。

以Kav對lgMw進行線性回歸處理，得線性回歸方程。樣品按上述條件上柱，求得Ve，根據(jù)其Kav值從標準曲線上求得樣品的分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 茯苓多糖的提取

稱取茯苓粉末100 g，采用水提醇沉法提取茯苓多糖，得茯苓粗多糖2.1 g，提取率為2.1%。

2.2 純度鑒定

采用紫外掃描法對除蛋白前后的茯苓多糖溶液進行純度鑒定，波長范圍190～600 nm，紫外掃描結(jié)果見圖1。

圖1 茯苓多糖溶液紫外掃描圖譜

由圖1可以看出，在270～290 nm處，吸收明顯減少，說明Sevag法對茯苓粗多糖中蛋白雜質(zhì)的去除效果較好。取茯苓粗多糖2 g，采用Sevag 法去雜質(zhì)，得精制茯苓多糖1.3 g，純化率為65%。

2.3 DEAE-650C柱層析

將精制多糖溶液進行DEAE-650C柱分離，硫酸-苯酚法顯色檢測，洗脫曲線見圖2。

1.TAP1 2.TAP2

由圖2可知，DEAE-650C柱層析后得兩個洗脫峰，且峰的對稱性較好。分別合并10～20管和50～61管的多糖洗脫液，透析后凍干，得茯苓多糖兩個組分。峰1為蒸餾水洗脫所得，初步判斷為中性多糖組分，命名為TAP1；峰2為NaCl溶液梯度洗脫所得，初步判斷為酸性多糖組分，命名為TAP2。

2.4 分子量測定

按1.6方法測定系列標準葡聚糖溶液的保留時間見表1。計算出各分子量標準品的lgMw和Kav，以Kav對分子量的對數(shù)作圖，結(jié)果見圖3。多糖分子量在10 000 ～500 000范圍內(nèi)與Kav呈良好線性關(guān)系，得回歸方程為y=-3.8951x+6.0471，R2=0.9994。

表1 不同分子量標準品的高效凝膠過濾色譜保留時間

圖3 葡聚糖標準曲線

將茯苓多糖兩組分TAP1和TAP2溶于蒸餾水中制成質(zhì)量體積比為2%的溶液，在相同色譜條件下進樣分析，保留時間分別為9.820 min和8.473 min。通過回歸方程計算得出分子量分別為11 721和44 065。

3 結(jié)論

用水提醇沉法對茯苓多糖進行提取，工藝流程簡便，提取的粗多糖易純化，但多糖得率低，僅為2.1%。茯苓提取工藝還待進一步研究。用Sevag法脫蛋白，其條件溫和且不引起多糖的降解，但需要重復(fù)多次。本實驗采用5次Sevag法脫蛋白，紫外掃描檢測表明去除效果較好，純化率為65%。

精制茯苓多糖經(jīng)DEAE-650C柱層析分離、純化，獲得TAP1和TAP2兩個多糖組分。TAP1為蒸餾水洗脫所得，初步判斷為中性多糖組分；TAP2為NaCl溶液梯度洗脫所得，初步判斷為酸性多糖組分。采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測定，中性茯苓多糖TAP1和酸性茯苓多糖TAP2的分子量分別為11 721、44 065。

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