微波輔助提取漢防己總生物堿及其中漢防己堿含量的測定

趙 華，李會鵬，廖克儉

(遼寧石油化工大學石油化工學院，遼寧 撫順 113001)

漢防己為防己科千金藤屬植物粉防己(Stephaniatetrandra.S.Moore)的塊根，具有抗菌、消炎、抗過敏、抗肝纖維化[1]、抗矽肺及逆轉腫瘤化療多藥耐藥性[2，3]、去屑止癢等功效。漢防己堿有效成分為生物堿，總生物堿含量達1.5%～2.3%，其中漢防己甲素(Tetrandrine，漢防己堿)約1%、漢防己乙素(Fangchinoline)約0.5%。目前漢防己甲素、乙素多采用乙醇提取，提取液經酸堿處理，再用氯仿萃取，或直接改用氨水堿化得總生物堿等[4]。微波技術已廣泛應用于中藥和天然產物生物活性成分的提取，如黃酮類、苷類、多糖、萜類、揮發(fā)油、單寧、甾體及有機酸等[5，6]，但用于漢防己總生物堿的提取還鮮有報道。

作者采用微波輔助法提取漢防己有效成分，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取工藝條件，并建立了HPLC法測定漢防己總生物堿中漢防己堿的方法，為其進一步開發(fā)利用提供科學依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

漢防己，市售。

漢防己堿對照品(含量99.8%)，中國藥品生物制品檢定所。

無水乙醇(含量99.7%)、丙酮、鹽酸、氨水，分析純；乙腈，色譜純；水為超純水。

79-1型磁力加熱攪拌器、YXYQ型循環(huán)水多用真空泵，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，遼陽市恒溫儀器廠；WD 800 G(2450 MHz)型微波爐，佛山格蘭仕電器廠；LC-10A型高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 方法

準確稱取漢防己粉末10 g，放入燒杯中，加入一定量一定體積分數(shù)的乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，放入微波爐中加熱，設定功率，每次輻射1 min，間隔1 min后再輻射1 min，如此間隔輻射直至總時間達到實驗設定值，抽濾。按同樣條件重復提取一次。合并兩次濾液，減壓蒸餾至無醇味。將剩余液倒入燒杯，加入10 mL 1%鹽酸，靜置48 h后用濾紙過濾去除沉淀，用濃氨水調濾液pH=9，放置48 h后抽濾，沉淀干燥后，用1.5 mL丙酮加熱溶解，在溶液中滴1～2滴蒸餾水至溶液微濁，放置待溶液揮干得白色結晶[7]，即漢防己總生物堿。

漢防己總生物堿提取率依下式計算：

1.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實驗

按1.2方法，固定其它因素不變，依次改變乙醇體積分數(shù)(A)、液料比(B，mL∶g，下同)、提取時間(C)、微波功率(D)，考察其對漢防己總生物堿提取率的影響。

1.3.2 正交實驗

基于單因素實驗結果設計L9(34)正交實驗，每個實驗重復3次，取平均值。正交實驗的因素和水平見表1。

表1 正交實驗的因素和水平

1.3.3 對比實驗

準確稱取漢防己粉末10 g，放入燒杯中，用55%的乙醇[500 mL·h-1，300 mL·(45 min)-1，200 mL·(30 min)-1]提取3次，合并提取液，回收乙醇至無醇味。其余步驟同1.2。

將實驗結果與優(yōu)化微波提取條件下的結果進行對比。

1.4 漢防己總生物堿定性檢驗

基于漢防己總生物堿與碘化鉍鉀、冰醋酸反應產生桔紅色渾濁或沉淀，定性檢測提取物中是否含有漢防己總生物堿[8]。

1.5 HPLC法測定漢防己堿含量

1.5.1 色譜條件

色譜柱ODS C18柱(4.6 mm×150 mm)；流動相：十二烷基磺酸鈉-乙腈-0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液 (0.15∶50∶50，pH=2)；流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL；檢測器靈敏度：0.001 AUFS。

1.5.2 對照品溶液的制備

精密稱取漢防己堿對照品10.00 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得20.0 μg·mL-1的漢防己堿對照品溶液。將此對照品溶液進一步稀釋至3.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1、9.0 μg·mL-1、12.0 μg·mL-1和15.0 μg·mL-1。

1.5.3 供試品溶液的制備

精密稱取實驗提取的總生物堿20.00 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解后稀釋至刻度，搖勻，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾，量取濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得20.0 μg·mL-1的供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 漢防己總生物堿的提取工藝

2.1.1 單因素實驗結果

單因素實驗結果表明：隨著乙醇體積分數(shù)的增大，漢防己總生物堿提取率逐漸上升，乙醇體積分數(shù)為60%時，提取率最高；液料比為13∶1時，漢防己總生物堿提取率最高，但溶劑用量太多，回收溶劑所需蒸餾時間太長，會造成部分損失；漢防己總生物堿提取率隨提取時間的延長而上升，提取時間為4 min時，達到最高，但是微波作用時間過長，會導致其它副產物產生；微波功率為320 W時，漢防己總生物堿提取率最高，但功率過大時，加熱升溫過快，溶液易沸騰而噴出，造成提取液損失。

2.1.2 正交實驗結果與方差分析(表2、表3)

表2 正交實驗的結果與分析

給定α=5 %，查表得Fα(2，2)=19。由表3可知，F(xiàn)B>19、FD>19，表明液料比和微波功率對提取率有顯著影響。綜合考慮，確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)55%、液料比13∶1(mL∶g)、提取時間3.5 min、微波功率480 W。

表3 方差分析

2.1.3 對比實驗結果(表4)

表4 微波輔助提取法和乙醇回流法結果對比

由表4可知，在乙醇體積分數(shù)和液料比相同的情況下，微波輔助提取法不僅提取率高，而且時間大大縮短，能耗省、成本低，優(yōu)勢明顯。

2.2 漢防己總生物堿的定性檢測

取少量提取液加入碘化鉍鉀、冰醋酸，產生桔紅色渾濁或沉淀，說明提取物中含有漢防己總生物堿。

2.3 HPLC法測定漢防己總生物堿中的漢防己堿含量

2.3.1 標準曲線

以測得峰面積積分值為縱坐標、漢防己堿進樣量(μg)為橫坐標繪制標準曲線，擬合線性回歸方程為：y=247.5x+24.3，相關系數(shù)R=0.9967 (n=5)，表明漢防己堿在0.06～0.30 μg(即6.0～30.0 μg·mL-1)范圍內線性關系良好。

2.3.2 穩(wěn)定性

精密吸取供試品溶液20 μL，每間隔60 min進樣測定，結果表明供試品溶液在5 h內基本穩(wěn)定，RSD=0.98%，n=6。

2.3.3 精密度

精密吸取對照品溶液20 μL，重復進樣5次，測定峰面積積分值分別為73.5、72.3、71.8、72.7和72.4，RSD=0.87%，n=5。

2.3.4 重現(xiàn)性

取漢防己總生物堿樣品5份，精密稱定，分別制備成供試品溶液進行測定，峰面積積分值分別為73.6、72.8、71.9、73.2、72.1，RSD=0.99%，n=5，表明方法的重現(xiàn)性好。

2.3.5 回收率

取已知含量的漢防己堿供試品溶液 6份，每份加入一定量漢防己堿對照品溶液，進行含量測定，平均回收率為99.98%，RSD=1.66%。表明加樣回收率良好。

2.3.6 漢防己堿的含量測定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖1所示。

a-漢防己堿峰

由圖1可知，圖譜中出現(xiàn)的保留時間差異不大，色譜分離的漢防己堿標準品峰形對稱，并與相鄰雜質峰能夠達到基線分離，定量值準確。漢防己堿含量為標示量的101.2%。按外標法計算，微波輔助提取法和乙醇回流法得到的漢防己總生物堿中漢防己堿的含量分別為56.55%和52.25%，即2.525 mg·mL-1和2.020 mg·mL-1，說明微波提取更利于有效成分的提取。

3 結論

(1)通過單因素實驗和正交實驗確定微波輔助提取漢防己總生物堿最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)55%、液料比13∶1(mL∶g)、提取時間3.5 min、微波功率480 W。

(2)微波輔助提取法和傳統(tǒng)的乙醇回流法相比，不僅提取率高，而且省時、節(jié)能、操作簡便，更能充分提取有效成分。

(3)建立了測定漢防己總生物堿中漢防己堿含量的HPLC方法，具有簡便、快捷、靈敏、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

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