靈芝多糖體外抗氧化活性的研究

張志軍，李淑芳，魏雪生，陳曉明

(天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300112)

在生物體生命活動(dòng)的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種自由基。自由基不僅是生物體多種生理功能的啟動(dòng)因素和生化反應(yīng)的介導(dǎo)者，同時(shí)也在免疫細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[1]?，F(xiàn)代生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，人類機(jī)體內(nèi)自由基的自穩(wěn)態(tài)平衡性下降，從而導(dǎo)致自身免疫功能下降，發(fā)生腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、Alzheimer型早老性癡呆等自由基疾病[2，3]。

靈芝(Ganodermalucidum)在我國(guó)自古就有“仙草”的美譽(yù)，已有悠久的藥用和食用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載[4]。多糖是靈芝中的主要活性組分之一。20世紀(jì)70年代以來(lái)，靈芝多糖的研究開發(fā)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展時(shí)期，經(jīng)過近30年的發(fā)展，人們對(duì)靈芝多糖這一重要生命物質(zhì)產(chǎn)生了新的認(rèn)識(shí)[5]。據(jù)報(bào)道，從雙孢蘑菇、靈芝、香菇、側(cè)耳等6種真菌中提取出的活性成分，可以防止細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷。劉志峰等研究證明，蘑菇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率可達(dá)29%。真菌提取物對(duì)自由基有一定的清除作用[6]。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，國(guó)內(nèi)外基本上采用水浸法、堿浸法提取多糖，再經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀提純。由于傳統(tǒng)工藝采用堿浸、有機(jī)溶劑分離提純等手段，易對(duì)靈芝多糖聚合體造成破壞，也易造成某些活性基團(tuán)變性失活，且粗多糖提取效率極低。膜分離技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的在分子水平上實(shí)現(xiàn)機(jī)械分離的高新技術(shù)，由于其具有常溫操作、無(wú)相態(tài)變化、高效節(jié)能、無(wú)污染等特點(diǎn)，且整個(gè)分離過程在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行，可避免和減輕熱和氧對(duì)物料營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，因此，被認(rèn)為是21世紀(jì)最有前途的技術(shù)。采用膜技術(shù)進(jìn)行靈芝多糖的分離純化，不僅收率高而且極少破壞靈芝多糖結(jié)構(gòu)[7]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

靈芝，天津市林業(yè)果樹研究所。

鄰苯三酚、番紅花T、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等，均為分析純。

恒溫水浴箱，752型分光光度計(jì)。

1.2 靈芝多糖的提取

(1)水提醇沉工藝

靈芝子實(shí)體→粉碎→粗濾→真空濃縮→醇沉→干燥

(2)膜分離工藝

靈芝子實(shí)體→粉碎→預(yù)煮→粗濾→微濾→超濾→濃縮干燥

1.3 性能測(cè)試

1.3.1 還原能力測(cè)定(鐵氰化鉀還原法)

在2.5 mL pH值6.6的磷酸緩沖溶液中加入1 mL樣品、2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合物在50℃恒溫條件下加熱20 min，急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r·min-1離心分離，取上層清液2.5 mL，加2.5 mL水，再加0.5 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)吸光度A700。A700值越大，則樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.2 對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

根據(jù)Fenton反應(yīng)原理，H2O2在Fe2+存在時(shí)生成·OH，反應(yīng)式如下：

·OH可使番紅花T褪色，即在520 nm處可測(cè)出·OH的生成情況，進(jìn)而檢測(cè)出加入樣品的抗氧化活性。反應(yīng)體系終體積4.5 mL，其中含150 mmol·L-1硫酸鈉鹽緩沖溶液(pH值7.4)、114 μmol·L-1番紅花T、1.927 mmol·L-1EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1硫酸亞鐵、3% H2O2以及不同濃度的樣品，在37℃恒溫水浴30 min后，加入0.3 mmol·L-1EDTA·Na2終止反應(yīng)，以緩沖溶液作參比，在520 nm處檢測(cè)其OD值?？瞻捉M以0.1 mL蒸餾水替代樣品，對(duì)照組以1.5 mL蒸餾水替代樣品和EDTA·Na2。按式(1)計(jì)算清除率：

(1)

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝多糖的還原能力測(cè)定

鐵氰化鉀還原法的原理為：

在波長(zhǎng)700 nm條件下測(cè)定吸光度A700，結(jié)果見表1。

表1 靈芝多糖的還原能力

由表1可知，0.10 mg·mL-1靈芝多糖溶液的A700值與水體系A(chǔ)700值相當(dāng)，說(shuō)明該濃度(均指加入反應(yīng)體系的樣品起始濃度，下同)下靈芝多糖沒有還原能力。隨著濃度的增大，A700值也增大，多糖的還原能力在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有較好的量效關(guān)系。以30 μg·mL-1Vc溶液的還原能力作參比，1.00 mg·mL-1多糖溶液的還原能力強(qiáng)于Vc。以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力，但靈芝多糖溶液還原能力的存在說(shuō)明靈芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

2.2 靈芝多糖的清除自由基作用

2.2.1 不同工藝提取的多糖對(duì)·OH的清除作用(表2)

表2 不同工藝提取的多糖對(duì)·OH的清除作用

由表2可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對(duì)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥自由基的清除率相應(yīng)增大，且量效關(guān)系非常明顯。在相同濃度下，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除羥自由基的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)的水提醇沉工藝，IC50分別為1.36 mg·mL-1、1.58 mg·mL-1。

表3 不同工藝提取的多糖對(duì)·的清除作用

由表3可知，隨著靈芝多糖濃度的增加，對(duì)鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除率相應(yīng)增大，且量效關(guān)系非常明顯。在相同濃度下，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)的水提醇沉工藝，IC50分別為2.55 mg·mL-1、2.83 mg·mL-1。

綜上所述，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除自由基的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)水提醇沉工藝。這是因?yàn)?，在靈芝多糖的提取過程中，傳統(tǒng)工藝采用了有機(jī)溶劑和多次高溫處理，使多糖的生物活性受到影響。

3 結(jié)論

(1)靈芝多糖濃度在0.10 mg·mL-1時(shí)，其A700值與水體系相當(dāng)，沒有還原能力；在1.00 mg·mL-1時(shí)，多糖溶液的還原能力強(qiáng)于30 μg·mL-1的Vc溶液；以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于Vc的還原能力。但靈芝多糖溶液還原能力的存在說(shuō)明靈芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

(2)對(duì)不同工藝提取的靈芝多糖的清除自由基能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明，膜分離工藝提取的靈芝多糖清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力均較好，并且清除能力和多糖濃度存在明顯的正相關(guān)量效關(guān)系。

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