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    大鼠在體腸灌注研究五味子有效成分腸吸收

    2011-07-25 06:37:24黎同明
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2011年12期
    關(guān)鍵詞:乙素甲素五味子

    貝 煜,于 洋,黎同明

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

    五味子為木蘭科植物Schisandra chinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果實(shí),習(xí)稱“北五味子”,性溫,味酸、甘,為常用收澀藥,具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效,用于久咳虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥狀。五味子的主要活性成分為木脂素類,如五味子醇甲(schisandrol A)、五味子酯甲(Schisantherin A)、五味子甲素(schisandrin A)和五味子乙素(schisandrin B)等[1]。現(xiàn)代研究表明,五味子主要活性成分具有顯著的保肝作用及逆轉(zhuǎn)P-gp所介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥性。雖然對其藥代動(dòng)力學(xué)研究的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道很多,但是對五味子木脂素的在體腸吸收機(jī)制研究鮮見報(bào)道。本文以北五味子為模型藥物,以主要活性成分五味子醇甲,甲素、乙素、酯甲為研究對象,建立適用于五味子木脂素吸收研究的大鼠原位灌注模型、研究五味子木脂素在不同濃度下以及在P-gp抑制劑共同作用下的吸收差異。為今后五味子口服制劑的研究提供依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 儀器

    HL-2恒流蠕動(dòng)泵(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);島津LC-2010C型高效液相色譜儀,SPD-M10AVP型二極管陣列檢測器,Shimadzu’LC solution色譜工作站(日本島津公司);722s可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);恒溫水浴鍋(江蘇金壇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

    1.2 藥品及試劑

    五味子藥材(廣州致信中藥飲片有限公司,批號:091020,產(chǎn)地:吉林);五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110857-201010);五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:111529-200503);五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110764-201010);五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110765-200710);維拉帕米(上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠);水合氯醛(天津百世化工有限公司);酚紅(天津市化學(xué)試劑研究所)。甲醇為色譜醇,其余試劑均為分析醇。

    1.3 動(dòng)物

    SD大鼠,體重(250±30)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 五味子醇提物的制備

    取五味子藥材干燥粉碎,過65目篩,得五味子粉末。精密稱取五味子粉末100g,用10倍量60%的乙醇加熱回流提取兩次,每次1h。合并提取液,靜置過濾,減壓回收乙醇,真空干燥后備用。

    2.2 溶液的配制

    Krebs-Ringer,s(K-R):稱取 NaCl 7.8g,KCl 0.35g,CaCl20.37g,NaHCO31.37g,NaH3PO40.32g,MgCl20.02g,葡萄糖1.4g,蒸餾水定容至1L,即得到pH7.4的KR液??瞻籽h(huán)液:K-R液進(jìn)行大鼠腸循環(huán)灌注3h,即得。酚紅K-R液:精密稱取酚紅20mg,置1000mL容量瓶中,加K-R液溶解,稀釋定容至刻度,搖勻,得到濃度為20μg·mL-1的酚紅 K-R液。

    2.3 大鼠原位腸循環(huán)灌注模型的建立[2]

    取實(shí)驗(yàn)前禁食12h(自由飲水)的SD大鼠,腹腔注射水合氯醛0.35mL·100g-1,麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔(約2.5cm),結(jié)扎膽總管,在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管兩端各切一小口,在上端小口處插入直徑為0.3cm的玻璃管,并用線扎緊。用注射器將(37±0.5)℃的生理鹽水緩緩注入腸管,洗去腸管內(nèi)容物至凈。然后在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管下端小口處插入玻璃管,并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動(dòng)泵的膠管連接,形成回路,開動(dòng)蠕動(dòng)泵。以5mL·min-1流速循環(huán)10min后,將流速調(diào)節(jié)為2.5mL·min-1,立即自裝有灌注液的錐形瓶中取樣1mL,作為測定零時(shí)間藥物濃度和酚紅濃度的樣品,另向錐形瓶中補(bǔ)加酚紅K-R液lmL,其后每隔20min亦按同法取樣并補(bǔ)加酚紅K-R液,循環(huán)3h后,中止實(shí)驗(yàn)。

    2.4 原位腸灌注實(shí)驗(yàn)法中參數(shù)計(jì)算[3]

    吸收速率常數(shù)(Ka):以小腸內(nèi)剩余藥量的對數(shù)(lnX)對取樣時(shí)間t作圖,得到一直線,從直線斜率可求吸收速率常數(shù)Ka(h-1):Ka=(InX0-InX)/t。表現(xiàn)滲透系數(shù)Papp:藥物透過胃腸道粘膜的表觀滲透系數(shù)Papp,單位為cm·s-1。A為小腸吸收面積(cm2)。Papp=Ka/A/3600。

    2.5 灌流液中酚紅濃度的測定

    由于腸灌流的過程中不但有水的吸收,還有水的分泌,導(dǎo)致循環(huán)液的體積發(fā)生變化,通過對酚紅濃度的測定來校正水的吸收。用空白腸灌流液加入酚紅配制濃度為10.2、20.4、40.8、61.2和81.6μg·mL-1等一系列標(biāo)準(zhǔn)液,取上述不同濃度的酚紅溶液各0.5mL,加入4.5mL 1.0mol·L-1的NaOH溶液顯色,于400~800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,在558nm處酚紅有最大吸收,因此于558nm處測定酚紅的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)、酚紅濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.6 灌流液中五味子4種有效成分濃度的測定

    色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm);Phenomenex C18預(yù)柱;流動(dòng)相:A 為甲醇,C為水(65∶35v/v);梯度洗脫:0~40min,65%~90%,40~45min,90%~65%;45~50min,A為65%,C為35%;流速為1mL·min-1,柱溫為35℃,檢測波長為235nm,進(jìn)樣量為50μL。對照品溶液的制備:分別精密稱取五味子醇甲,五味子酯甲,五味子甲素,五味子乙素對照品0.00220g,0.00159g,0.00126g,0.00145g,置于100mL容量瓶中,加入酚紅 K-R液-甲醇(1∶1,V/V),定容至刻度。得到混合對照品溶液。供試液的制備:精密稱取五味子醇提物干膏1g,置于錐形瓶中,加入2.5mL DMSO和2.5mL無水乙醇超聲溶解,得到五味子醇體液儲(chǔ)備液。分別取五味子醇體液儲(chǔ)備液0.5mL,1mL和2mL,置于容量瓶中,加入酚紅 K-R液,超聲溶解,并稀釋定容到刻度,搖勻,使五味子醇提物的濃度為1mg·mL-1、2mg·mL-1和4mg·mL-1。樣品的處理:精密吸取腸灌流液0.5mL,加0.5mL甲醇,渦旋混合1min,過0.45μm微孔濾膜。在上述色譜條件下進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素混合對照品儲(chǔ)備液適量,按倍數(shù)稀釋法,用K-R溶液:甲醇(1∶1,V/V)溶液稀釋,得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。在上述色譜條件下進(jìn)樣測定,記錄色譜圖,以濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    2.7.1 五味子4種有效成分在K-R液中的穩(wěn)定性考察

    用空白腸灌流液配制濃度為2mg·mL-1的五味子醇提取物,置于密閉容器中,37℃水浴3h,分別于0、1、2、3h取樣,測定五味子醇提取物中4種有效成分的含量,并計(jì)算其剩余百分率()。

    2.7.2 五味子4種有效成分在不同pH值K-R液中的穩(wěn)定性考察

    用1.0mol·L-1HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)空白K-R液到不同的pH值分別為5.01、6.84和7.97.然后分別用這3種pH值的K-R液配制濃度為2mg·mL-1的五味子醇提取物作為供試液,置于密閉容器中,于37℃水浴中放置3h,分別于0、1、2、3h取樣測定五味子提取物中4種有效成分的濃度,并計(jì)算其剩余百分率()。

    2.8 五味子總木脂素不同劑量組大鼠的吸收研究

    用酚紅 K-R液分別配制濃度為1mg·mL-1、2mg·mL-1和4mg·mL-1五味子醇提物作為供試品溶液。取SD大鼠15只,隨機(jī)分成三組,按照“2.1”的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,結(jié)扎膽管后,自十二指腸上部及回盲腸末端插管,分別用供試液1、2、3進(jìn)行原位腸循環(huán)灌注,定時(shí)取樣,測定各時(shí)間點(diǎn)的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的濃度,然后按照“2.4”計(jì)算其 Ka、Papp。

    2.9 P-gp抑制劑對五味子總木脂素腸吸收機(jī)理和吸收調(diào)控的研究

    用酚紅K-R液分別配置濃度為2mg·mL-1五味子醇提物作為對照組溶液,加入維拉帕米(0.1mg·mL-1)作為供試品溶液。取SD大鼠15只,隨機(jī)分成三組,分別考察小腸的吸收。按照“2.3”的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作進(jìn)行原位腸循環(huán)灌注,定時(shí)取樣,測定各時(shí)間點(diǎn)的五味子甲素、乙素、醇甲、酯甲的濃度,然后按照“2.4”計(jì)算其 Ka、Papp。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 灌流液中酚紅濃度的測定

    以吸光度A與酚紅濃度C(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸,得酚紅測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0162X+0.0255,r=0.9999(n=5),線性范圍為10.20~81.6μg·mL-1,RSD為0.68%,平均回收率為100.1%。

    3.2 灌流液中五味子4種有效成分濃度的測定

    圖1 腸灌流液中4種有效成分的HPLC色譜

    五味子醇甲:Y=201524X+33188,r=0.9997,線性范圍為0.088~22.000μg.mL-1;五味子酯甲:Y=318516X+14207,r=0.9998,線性范圍為0.064~15.900μg.mL-1;五味子甲素:Y=223174X+10514,r=0.9998,線性范圍為0.050~12.600μg.mL-1;五味子乙素:Y= 203827X+6826.2,r=0.9998,線性范圍為0.029~14.500μg.mL-1。五味子醇甲、酯甲、甲素、乙素的平均回收率分別為(100.56±2.08)%、(99.03±1.78)%、(100.59±1.49)%和(98.28±1.42)%,RSD分別為為2.06%、1.80%、1.48%和1.44%。以上結(jié)果表明,五味子木脂素4種有效成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系并具有較好的回收率。

    3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    3.3.1 五味子4種有效成分在K-R液中的穩(wěn)定性考察

    濃度為1mg·mL-1、2mg·mL-1和4mg·mL-1的五味子提取物在空白大鼠腸灌流液中的穩(wěn)定性見表1,結(jié)果顯示,高、中、低3個(gè)濃度的五味子提取物中4種有效成分在空白腸灌流液中3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    表1 五味子4種有效成分在37℃灌流液中的穩(wěn)定性(n=3,)

    表1 五味子4種有效成分在37℃灌流液中的穩(wěn)定性(n=3,)

    五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高劑量組 99.57±0.8199.17±1.63101.67±1.67100.01±1.65中劑量組 99.09±0.9199.67±0.77101.10±1.17101.10±1.91低劑量組 99.82±1.55101.96±1.47100.37±0.9799.33±0.82

    3.3.2 五味子4種有效成分在不同pH值K-R液中的穩(wěn)定性考察

    表2 五味子4種有效成分在不同pH值灌流液中的穩(wěn)定性(n=3,)

    表2 五味子4種有效成分在不同pH值灌流液中的穩(wěn)定性(n=3,)

    五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素5.0199.27±1.2698.00±2.0498.46±1.5699.47±0.566.4899.38±0.6998.32±1.4298.37±1.5199.27±0.627.9799.24±0.5498.80±2.15100.90±0.79100.42±0.64

    濃度為2mg·mL-1的五味子提取物在不同pH值的空白大鼠腸灌流液中的穩(wěn)定性見表2,結(jié)果顯示,五味子提取物中4種有效成分在pH值為5.01~7.79范圍內(nèi)的空白腸灌流液中3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    3.4 五味子總木脂素不同劑量組大鼠的吸收研究

    表3 五味子高中低劑量組灌流液中4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值(n=5,)

    表3 五味子高中低劑量組灌流液中4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值(n=5,)

    五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素高劑量組 Ka 0.137±0.018 0.297±0.034 0.458±0.087 0.47 S 0.174中劑量組 Ka 0.126±0.032 0.303±0.092 0.449±0.080 0.396±0.031 Papp×10-6cm·sec-1 0.317±0.079 0.766±0.233 1.133±0.203 1.169±0.203低劑量組 Ka 0.127±0.035 0.284±0.081 0.438±0.188 0.390±0.043 Papp×10-6cm·sec-1 0.319±0.088 0.717±0.206 1.107±0.048 1.086±0.1089±0.069 Papp×10-6cm·sec-1 0.344±0.045 0.751±0.085 1.156±0.219 1.210±

    3.5 P-gp抑制劑對五味子總木脂素腸吸收研究

    表4 P-gp抑制劑后五味子4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值(n=5,)

    表4 P-gp抑制劑后五味子4種有效成分的腸吸收的Ka和Papp值(n=5,)

    注:*P<0.05vs control of Ka;△P<0.05vs control of Papp。

    五味子醇甲 五味子酯甲 五味子甲素 五味子乙素維拉帕米 Ka 0.143±0.022 0.434±0.126* 0.437±0.035* 0.429±0.014*Papp×10-6cm·sec-1 0.340±0.055 1.097±0.318△ 1.106±0.088△ 1.081±0.033△0.083對照組 Ka 0.166±0.035 0.310±0.074 0.336±0.031 0.363±0.024 Papp×10-6cm·sec-1 0.420±0.088 0.784±0.187 0.879±0.097 0.929±

    由以上各表可知,五味子4種有效成分,在考察的濃度范圍以內(nèi),濃度增加一倍,吸收速率(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)卻沒有顯著性差異(P>0.05),并不符合Fick s方程。這提示在所考察的濃度范圍內(nèi)五味子4種有效成分不只是單純的被動(dòng)擴(kuò)散,而是存在載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)方式。加入P-gp抑制劑維拉帕米(VP)與正常組相比,五味子酯甲、甲素和乙素這三種有效成分的吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)都顯著增加(P<0.05)。這種促進(jìn)吸收的效果是通過抑制P-gp的外排而起作用的,提示五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素是P-gp的底物。

    4 討論

    藥物的口服吸收是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程,其中透膜過程是關(guān)鍵。藥物透膜過程主要有三種機(jī)制:被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(passive transport)、載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)(carrier-mediated transport)和膜動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane mobile transport)。藥物在體內(nèi)的吸收大多數(shù)是在小腸中進(jìn)行的,從不同劑量組對五味子總木脂素吸收影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,在考察的濃度范圍以內(nèi)五味子4種有效成分并沒有體現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,轉(zhuǎn)運(yùn)過程不符合Ficks擴(kuò)散定律,說明五味子在考察的濃度范圍內(nèi)可能是屬于載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)。載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)是:①需要消耗機(jī)體能量,能量來源主要由機(jī)體細(xì)胞代謝產(chǎn)生的ATP提供;②需要載體的參與,載體往往是細(xì)胞膜上的膜蛋白或者是標(biāo)志酶,與藥物本身有較高的選擇性;③主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率和轉(zhuǎn)運(yùn)量與載體的量及其活性有關(guān),當(dāng)藥物濃度較低的時(shí)候,載體的量和活性相對較高,藥物轉(zhuǎn)運(yùn)速率快。當(dāng)藥物濃度逐漸升高時(shí),載體趨于飽和,轉(zhuǎn)運(yùn)速率減慢,甚至轉(zhuǎn)運(yùn)飽和,加上結(jié)構(gòu)相似的化合物之間相互競爭載體結(jié)合位點(diǎn)而影響轉(zhuǎn)運(yùn)。五味子總木脂素4種有效成分高中低三個(gè)濃度可能處在載體濃度飽和階段,加上4種組分基本構(gòu)架相似,產(chǎn)生競爭結(jié)合的現(xiàn)象,因而當(dāng)濃度加倍增加,吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速率并沒有明顯的提高。

    多藥耐藥(MDR)是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的最重要的防御機(jī)制。MDR是由一種藥物誘發(fā)的、對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相似的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象,是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。能否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥,是提高化療療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實(shí),五味子乙素對P-糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞 MDR有明確的逆轉(zhuǎn)效果[4]。李玲等[5]研究證實(shí)五味子乙素具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)介導(dǎo)的白血病多藥耐藥細(xì)胞株 HL-60/ADR,HL-60/MRP耐藥的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[6-9],五味子粗提物及其有效成分五味予甲素逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果很明顯。在與抗腫瘤藥物長青新堿、紫杉醇、阿霉素合用對抑制小鼠肉瘤S180生長的增強(qiáng)作用實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),五味子粗提物與這3種藥物合用后,三藥抑瘤作用均有一定程度的增強(qiáng),抑瘤率分別達(dá)到51.66%、38.11%和53.05%。在機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn):①五味子能增加抗腫瘤藥在耐藥腫瘤細(xì)胞中的蓄積,從而增強(qiáng)其療效;②能夠抑制P-糖蛋白的表達(dá),提示至少部分通過直接或間接地干擾P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物而發(fā)揮其作用;③能顯著增加阿霉素誘導(dǎo)肝癌BEL 7402細(xì)胞發(fā)生凋亡的易感性:④鈣拮抗劑VER能部分拮抗二氫吡啶類鈣激動(dòng)劑BAYK8644介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加,提示五味子甲素本身無鈣拮抗活性。近年來,天然藥物的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂和抗菌消炎等藥理作用成為研究的熱點(diǎn),而五味子木脂素的這一發(fā)現(xiàn)無疑讓五味子在腫瘤藥物的研發(fā)領(lǐng)域中占據(jù)了重要的位置,為天然藥物抗腫瘤提供了新的思路和新的方向。

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