揮發(fā)性有機物對大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞體外毒性的實驗研究

張煥珠，宋偉民

（上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200126）

揮發(fā)性有機化合物（VOCs）是指在常溫下，沸點50℃～260℃的各種有機化合物。VOCs按其化學結(jié)構(gòu)，可以進一步分為烷類、芳烴類、酯類、醛類和其他等。目前已鑒定出的有300多種，最常見的有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、三氯乙烯、三氯甲烷、三氯乙烷、二異氰酸酯（TDI）、二異氰甲苯酯等。VOCs是造成室內(nèi)空氣污染的主要原因之一。揮發(fā)性有機物為親脂性化合物，腦組織是其主要靶器官之一，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外界危害因素極為敏感，當受到侵襲時常首先受累。星形膠質(zhì)細胞的作用不僅僅是支持和營養(yǎng)神經(jīng)元，還參與神經(jīng)元發(fā)育至神經(jīng)損傷的各種復雜過程。星形細胞培養(yǎng)具有細胞單一、觀察直接等優(yōu)點，已成為篩選神經(jīng)毒物，探索毒作用機制的重要方法［1－2］。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材

高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司），多聚－L－賴氨酸、胎牛血清（Hyclone公司），L－谷胺酰氨（上海伯奧生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海華美生物有限公司），青霉素、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）、MTT，酶標儀，Beckman液體閃爍測定儀，超凈工作臺。CO2細胞培養(yǎng)箱（Napco，法國），倒置顯微鏡（Leica，德國），UnicoTM2000型分光光度計，6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板（Costar）。實驗動物：SD新生大鼠（1～3天齡），由上海醫(yī)科大學動物部提供。

1.2 分離培養(yǎng)方法

選取出生2d內(nèi)的正常SD仔鼠，頸動脈放血，取腦，將皮層組織移入D－Hank＇s液中，用吸管輕輕吹打，放置5min，取上清，進行離心（5min，1500轉(zhuǎn)／min）。棄上清，加入DMEM營養(yǎng)液（每升含6g葡萄糖，4mmol L－谷胺酰氨，10mM HEPES，1×105U青霉素，100mg鏈霉素，150mL胎牛血清），調(diào)整細胞濃度為1×106／mL，接種于培養(yǎng)瓶中，將此濃度細胞懸液接種于預(yù)先鋪好多聚－L－賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，以后每周換液2～3次。

1.3 揮發(fā)性有機化合物儲備液處理

將分析純試劑苯、甲醛、乙苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯配制成混合物（甲苯34.1%、乙苯19.5%、二甲苯31.7%、苯7.3%、苯乙烯7.4%、甲醛9.3%），調(diào)節(jié)溶液pH 值為6.0，0.25μm濾膜濾過除菌。

1.4 MTT實驗

MTT［32（4，52二甲基噻唑）22，52二甲基四唑溴鹽］（Sigma）首先用 HBSS配制成5g／L的儲備液，0.25μm 濾膜濾過除菌，4℃避光可保存7天，使用前稀釋至所需工作液濃度。細胞培養(yǎng)3d，加入含不同揮發(fā)性有機物濃度的溶液，使終濃度為低濃度組（VOCs 3mmol／L），中濃度組（VOCs 6mmol／L），高濃度組（VOCs 9mmol／L）培養(yǎng)3d，每孔加入MTT15μL（115g／L），37℃孵育4h，棄去上清，每孔加入DMSO 100μL，室溫下放置10min，測定MTT光吸收值。按如下公式計算細胞活性：細胞活性（%）＝OD暴露－OD空白／OD對照－OD空白。

1.5 LDH實驗

乳酸脫氫酶（LDH）釋放量的測定將純化后的星形膠質(zhì)細胞每毫升約1.3×106的細胞數(shù)，接種于24孔板中，培養(yǎng)3d后分組加入VOCs儲備液即對照組，使終濃度為對照組（VOCs 0mmol／L）、低 濃 度 組 （VOCs 3mmol／L）、中 濃 度 組 （VOCs 6mmol／L）、高濃度組（VOCs 9mmol／L）。培養(yǎng)72h后，吸取每孔板中的全部培養(yǎng)液，進行LDH活性（U／L）測定。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

與揮發(fā)性有機物共同培養(yǎng)24h后，細胞形態(tài)未見明顯異常，48h后細胞開始失去正常的形態(tài)，變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，細胞形態(tài)隨著染毒濃度增加改變加重，細胞也變得稀疏起來。

2.2 MTT實驗

從圖1中可以看出，隨著染毒濃度的增加，細胞活性隨之下降，在6mM和9mM組下降水平與對照組比較，有顯著性差異，P值分別＜0.05和＜0.01。

圖1 VOCs暴露對細胞活性的影響

2.3 LDH實驗

圖2顯示了VOCs對星形膠質(zhì)細胞外乳酸脫氫酶的影響，可以看出，隨著染毒濃度的增加，細胞膜受損程度增加，細胞外乳酸脫氫酶含量增加，在9mm組達到顯著差異（P＜0.01）。

圖2 VOCs暴露對細胞外LDH含量的影響

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時，最早和最顯著細胞反應(yīng)之一［3］。這種反應(yīng)表現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）的過度表達上。GFAP免疫反應(yīng)陽性細胞的增加不是由于星形膠質(zhì)細胞的增殖，而是每個星形細胞GFAP表達的增強。關(guān)于揮發(fā)性有機物中甲苯的神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究較多，在體外條件培養(yǎng)下，接觸甲苯的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，均表現(xiàn)了酶活性的改變。甲苯抑制神經(jīng)突觸體和星形膠質(zhì)細胞膜的Na＋，K＋－ATP酶和 Mg2＋－ATP酶活性，使膜脂流動性增加［4］。Engelke等［5］將大鼠腦皮層神經(jīng)細胞突觸體暴露于甲苯，結(jié)果ATP酶活性呈線性下降，在最高濃度組（8mmol），ATP酶活性下降了近50%，乙酰膽鹼脂酶活性也呈下降趨勢。也有研究發(fā)現(xiàn)，星形細胞在體外接觸甲苯1h，Na＋，K＋－ATP酶活性輕度下降，與對照組比較無顯著性差異，而Mg2＋－ATP酶活性明顯低于對照組，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系（P＜0.005）［6］。星形細胞是維持神經(jīng)元正常穩(wěn)態(tài)環(huán)境的細胞，細胞膜ATP酶起著重要作用。甲苯可通過酶的抑制作用而干擾星形細胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能，并對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生毒作用。大鼠暴露于甲苯，可使海馬、小腦以及齒狀回反應(yīng)性的神經(jīng)膠質(zhì)增加，GFAP表達增加［7－8］，而在丘腦部位GFAP表達減少［9］。體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞急性暴露于甲苯，細胞凋亡增加，細胞分裂素（絲裂原）活化蛋白激酶（MAPK）活性增加，可能是一種保護性反應(yīng)［10］。本次實驗結(jié)果表明，暴露于揮發(fā)性有機物，可對星形膠質(zhì)細胞的生長、形態(tài)造成一定損害，表現(xiàn)為細胞形態(tài)為多角形或不規(guī)則形，細胞較對照組稀疏，并隨濃度增加形態(tài)改變加重，從MTT實驗結(jié)果可以看出暴露于VOCs，細胞活力下降。本次實驗可以看到細胞外乳酸脫氫酶活力隨染毒濃度增加而升高，說明VOCs可以使星形膠質(zhì)細胞膜完整性受損。

綜合本次實驗結(jié)果，VOCs可以對星形膠質(zhì)細胞造成毒性損害，從而影響星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、營養(yǎng)支持作用以及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用，導致腦組織正常的結(jié)構(gòu)和功能改變，引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀。

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