迷迭香酸對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)理探討

高麗萍，張文斌，景玉宏，鄭榮梁

（1.蘭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200240；3.蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

迷迭香酸是有一定生理活性的酚酸類化合物，為丹參素與咖啡酸的縮合物。迷迭香酸是許多唇形科植物如迷迭香、羅勒、檸檬香蜂草和留蘭香的主要成分。其分子結(jié)構(gòu)中有四個(gè)酚羥基，具有多種生物活性，包括抗氧化［1］，抗過(guò)敏［2］、抗炎和抗病毒作用［3］，對(duì)肝損傷和肺損傷也具有保護(hù)作用［4，5］。我們研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可以抑制H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡［6］，Iuvone等［7］研究表明迷迭香酸可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受β－淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，這些研究表明迷迭香酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有一定保護(hù)作用。因此，我們利用線栓法制作了腦缺血／再灌注動(dòng)物模型，研究迷迭香酸對(duì)大鼠腦缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物與試劑

迷迭香酸購(gòu)自Sigma公司。2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）為中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。SOD、GSH－Px和MDA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重200～280g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器

病理圖象分析系統(tǒng)（四川大學(xué)產(chǎn)品），UV29100紫外可見(jiàn)分光光度儀（北京第二光學(xué)儀器廠產(chǎn)品）。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

大鼠35只隨機(jī)分為5組，腹腔注射給藥3天后用線栓法造模［8］，缺血4h后再灌注2h，然后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.2 行為學(xué)評(píng)分［9］

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①提鼠尾，左前肢內(nèi)收，左肩內(nèi)旋者1～4分。②將大鼠置光滑平面，推右肩向左側(cè)移動(dòng)，阻力降低者1～3分。③左前肢肌張力降低1～3分。共10分。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物的行為障礙越顯著。

1.4.3 腦梗塞體積的測(cè)定

大鼠股動(dòng)脈取血然后迅速斷頭處死，連續(xù)冠狀切片，迅速放入2%TTC溶液（37℃）中染色30min，缺血區(qū)呈蒼白色，正常區(qū)為玫瑰色，采用病理圖象分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗塞體積所占百分比。

1.4.4 MDA含量測(cè)定

大鼠股動(dòng)脈取血制備血清，測(cè)定血清MDA含量。

1.4.5 SOD和 GSH－Px的活力測(cè)定

采用SOD和GSH－Px試劑盒測(cè)定血清SOD和GSHPx的活力。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 迷迭香酸對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

除假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)缺損的癥狀外，其余各組出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)缺損的癥狀。表現(xiàn)為左前肢內(nèi)收；軀體向病灶對(duì)側(cè)傾斜，向左側(cè)推阻力下降；部分大鼠活動(dòng)時(shí)有向癱瘓側(cè)打轉(zhuǎn)現(xiàn)象。與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)缺損癥狀。與模型組比較，迷迭香酸10、50mg／kg及葛根素50mg／kg均能顯著改善大鼠神經(jīng)缺損的癥狀（P＜0.01）。在劑量相同時(shí)，迷迭香酸的作用與葛根素相當(dāng)（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)和腦梗塞體積的影響（n＝7，）

表1 迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)和腦梗塞體積的影響（n＝7，）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg） 行為學(xué)評(píng)分 腦梗塞體積（%）假手術(shù)對(duì)照組 —— 0＊＊ 0＊＊模型組 —— 7.14±0.83 22.92±1.92葛根素 50 5.5±0.5＊＊ 17.77±3.90＊迷迭香酸 10 4.86±0.64＊＊ 18.78±2.43＊＊迷迭香酸 50 4.57±0.73＊＊ 17.74±3.50＊＊

2.2 迷迭香酸對(duì)大鼠腦梗塞體積的影響

與假手術(shù)組比較，模型組出現(xiàn)嚴(yán)重的腦梗塞，腦梗塞體積為（22.92±1.92）%。與模型組比較，迷迭香酸10和50mg／kg對(duì)腦梗塞體積均有顯著的降低作用，分別使梗塞體積降低到（18.78±2.43）%和（17.77±3.90）%。在劑量相同時(shí)，迷迭香酸的作用與葛根素相當(dāng)（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 迷迭香酸對(duì)大鼠血清MDA含量的影響

模型組與假手術(shù)組比較，血清MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，葛根素50mg／kg使 MDA含量降低39.69%，迷迭香酸10和50mg／kg分別使MDA含量減低42.05%和45.52%（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量、SOD和GSH－Px活力的影響（n＝7，）

表2 迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量、SOD和GSH－Px活力的影響（n＝7，）

注：與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量（mg／kg）MDA（nmol／mL）SOD（NU／mL）GSH－Px（活力單位）假手術(shù)對(duì)照組—— 6.24±1.24＊＊ 157.03±8.26＊393.86±12.87＊＊模型組 —— 14.41±2.77141.02±14.34358.79±17.95葛根素 508.69±1.59＊＊ 164.04±5.76＊＊385.37±9.56＊＊迷迭香酸 108.35±2.18＊＊ 157.97±5.98＊ 372.93±4.71迷迭香酸 507.85±1.56＊＊ 161.47±4.21＊＊381.70±12.53＊

2.4 迷迭香酸對(duì)大鼠血清SOD和GSH－Px活力的影響

模型組與假手術(shù)組比較，血清SOD活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，葛根素50mg／kg使血清SOD活性增加1.16倍，迷迭香酸10和50mg／kg分別使血清SOD活性增加1.12和1.15倍（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

模型組與假手術(shù)組比較，血清GSH－Px活性顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，葛根素50mg／kg使血清 GSHPx活性增加1.07倍，迷迭香酸50mg／kg使血清GSH－Px活性增加1.06倍（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

大腦中動(dòng)脈（MCA）是人群腦缺血的多發(fā)部位，MCA閉塞模型被普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，而插線法這種模型無(wú)須開(kāi)顱，MCA閉塞效果較理想，是目前能進(jìn)行再灌流損傷研究的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型，觀察迷迭香酸對(duì)大鼠腦缺血的影響。結(jié)果顯示迷迭香酸可減少大腦中動(dòng)脈阻斷所致的腦梗塞體積，改善腦缺血大鼠的行為障礙。研究結(jié)果表明迷迭香酸對(duì)腦缺血性損傷具有明顯的保護(hù)作用。

涉及再灌注損傷機(jī)制的因素有許多，其中氧自由基的生成在其中起重要作用。一般認(rèn)為，腦缺血時(shí)自由基的損害以腦缺血后再灌注為甚，可能是不完全性腦缺血?dú)埩舻牡螤罟┭?，提供微量氧氣，使脂質(zhì)過(guò)氧化得以維持進(jìn)行，加重?fù)p害。脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物（MDA）有很強(qiáng)的毒性和反應(yīng)性，它們可使脂質(zhì)過(guò)氧化在細(xì)胞膜系統(tǒng)蔓延導(dǎo)致細(xì)胞功能的破壞，所以測(cè)量脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物被認(rèn)為是氧自由基損傷的重要指標(biāo)。在正常狀態(tài)下，機(jī)體ROS的產(chǎn)生和清除間存在著動(dòng)態(tài)的平衡，產(chǎn)生的自由基可被SOD、GSH－Px和過(guò)氧化氫酶等清除，測(cè)定抗氧化酶類的活性可以間接反應(yīng)體內(nèi)清除自由基的能力變化。腦缺血再灌注時(shí)，ROS的生成過(guò)多，超過(guò)了抗氧化酶對(duì)它的清除，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。腦缺血大鼠再灌注后，MDA含量明顯升高，SOD和GSH－Px顯著降低，表明腦缺血再灌注期脂質(zhì)過(guò)氧化增加，機(jī)體抗氧化能力降低。迷迭香酸能顯著降低MDA含量，提高SOD和GSH－Px的活性，表明迷迭香酸對(duì)腦損傷的保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)。

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