青霉素與牛血清白蛋白相互作用研究

魏 海，魏 霞

（1.四平市婦嬰醫(yī)院，吉林 四平 136000；2.四平巨能藥業(yè)有限公司，吉林 四平 136000）

研究蛋白質(zhì)與藥物的相互作用不僅可以優(yōu)化藥物分子結(jié)構(gòu)、優(yōu)化處方和給藥途徑，還可以為提高藥物的生物利用率和生物效應(yīng)提供有用的信息。血清白蛋白能與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合，從而起到重要的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)作用［1，2］。人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）二者的氨基酸序列高度相似，所以科學(xué)家通過(guò)研究藥物與BSA相互作用作為對(duì)HSA結(jié)合情況的參考。熒光光譜法因其操作簡(jiǎn)單、快捷成為眾多研究方法中的熱點(diǎn)［3，4］。通過(guò)藥物對(duì)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的猝滅現(xiàn)象，確定猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)，可以了解藥物和蛋白的作用機(jī)理和作用強(qiáng)度。本文利用熒光光譜研究了生理?xiàng)l件下青霉素與牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制，以及它們對(duì)BSA微環(huán)境的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

本實(shí)驗(yàn)所用到的主要試劑有青霉素（AR，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司）；牛血清白蛋白（AR，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；本實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。熒光光譜通過(guò)日本島津公司生產(chǎn)的RF－5301PC型熒光光譜儀獲得。

1.2 溶液配制

Tris－HCl溶液的配制：精確稱取0.5841g的氯化鈉溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，再分別移取25mL濃度為0.2mol／L的Tris水溶液，以及40mL濃度為 0.1mol／L的HCl溶液至容量瓶中，最后用去離子水定容，配制成Tris－HCl鹽酸緩沖液。

BSA溶液的配制：精確稱取0.0750gBSA，用Tris－HCl溶液定容于1000mL容量瓶中，配制成1.67×10－5mol／L的BSA溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

分別定量移取“1.2”中配制的BSA和青霉素溶液于比色管中，在波長(zhǎng)范圍為220～650nm，狹縫為0～3.0nm，激發(fā)波長(zhǎng)為281nm條件下，記錄熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 青霉素和BSA的紫外及熒光光譜

圖1為BSA和青霉素在激發(fā)波長(zhǎng)為281nm時(shí)的熒光光譜，可以看出BSA在328nm處有一特征峰，此峰為BSA在Trp－134和212位上色氨酸殘基（Trp）的特征峰。而青霉素在同樣條件下無(wú)特征吸收，為此本文以328nm作為青霉素與BSA作用的分析波長(zhǎng)。探討青霉素對(duì)BSA的熒光猝滅作用。

圖1 青霉素（a）和BSA（b）的熒光光譜

2.2 結(jié)合常數(shù)Kq的確定

動(dòng)態(tài)猝滅是熒光體與猝滅體由于熱運(yùn)動(dòng)等發(fā)生碰撞而引起的，靜態(tài)猝滅是熒光體與猝滅體形成絡(luò)合物，從而使熒光體的熒光猝滅。為了確定此猝滅過(guò)程的機(jī)制，先按動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程處理，那么服從Stern－Volmer方程［5］：

其中F0為猝滅體不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入猝滅體后的熒光強(qiáng)度，kq為雙分子猝滅常數(shù)，c（Q）為猝滅體濃度，τ0為猝滅體不存在時(shí)熒光體的熒光壽命，τ0＝1ns，kq為Stern－Volmer常數(shù)，以F0／F－1對(duì)c（Q）作圖，結(jié)果如圖2。

圖2 BSA的熒光強(qiáng)度Fo／F－1與青霉素的Stern－Volmer

根據(jù)圖2可得青霉素與BSA在281nm波長(zhǎng)激發(fā)下的雙分子猝滅常數(shù)kq＝2.46×1012mol／L·s。此值遠(yuǎn)大于各種猝滅體對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010mol／L.S［6］，說(shuō)明了此猝滅過(guò)程是由于熒光分子和猝滅劑之間形成不發(fā)光的基態(tài)配合物的結(jié)果，即發(fā)生了靜態(tài)猝滅［7］。圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在281nm波長(zhǎng)激發(fā)下，BSA的熒光峰位在328nm，隨著青霉素濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度有了不同程度的猝滅，而且BSA的熒光峰位沒(méi)有發(fā)生改變，所以初步確定加入藥物后，BSA的結(jié)構(gòu)基本上沒(méi)有發(fā)生變化。由此推測(cè)，此猝滅過(guò)程可能是由于青霉素與BSA形成了締合物而引起的靜態(tài)猝滅，也就是說(shuō)此猝滅過(guò)程是由于藥物與BSA在基態(tài)時(shí)生成了復(fù)合物，從而導(dǎo)致BSA的熒光強(qiáng)度猝滅。

自上而下青霉素的濃度分別為0，3.34×10－5，6.68×10－5，1.002×10－4，1，336×10－4，1.670×10－4，2.004×10－4，2.338×10－4，2.672×10－4，3.006×10－4，3.340×10－4mol／L。

根據(jù)方程［8］：

圖3 青霉素對(duì)BSA的熒光猝滅

以（F0／F0－F）－1對(duì)1／c（Q）作 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖（如圖4），直線斜率即為青霉素與BSA在281nm激發(fā)下的結(jié)合常數(shù)k＝3.347×10－3（K／mol）。

圖4 BSA的熒光強(qiáng)度與青霉素的雙倒數(shù)

3 結(jié)論

利用熒光光譜分析技術(shù)研究了青霉素和牛血清白蛋白相互作用機(jī)制，根據(jù)Lineweave－Burk雙倒數(shù)圖，求出了在281nm波長(zhǎng)激發(fā)下青霉素與BSA作用的結(jié)合常數(shù)k＝3.347X10－3K／mol；依據(jù)Stern－Volmer方程，以F0／F－1對(duì)c（Q）作圖，求出了在281nm波長(zhǎng)激發(fā)下青霉素與BSA作用的雙分子猝滅常數(shù)kq，kq＝2.46×1012mol／L·s。

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