活體小鼠腦組織Ca2+敏感熒光染料雙光子成像的觀察*

彭詩(shī)宇，任振華,徐金勇,顧懷宇,李光武,

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究所，安徽 合肥230032；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，安徽 合肥 230032；3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)的一大挑戰(zhàn)就是如何對(duì)活體動(dòng)物大腦進(jìn)行有效的成像觀察與記錄。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)動(dòng)物腦組織結(jié)構(gòu)的觀察多數(shù)停留在形態(tài)學(xué)染色的層面上，這類方法雖然有效，但對(duì)于活動(dòng)腦組織的觀察卻無(wú)能為力[1]。也有許多有效觀測(cè)活體動(dòng)物腦組織的方法，如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的電生理記錄，功能性核磁共振(Functional Magnetic Resonance Image,FMRI)[2]，正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)掃描(Position Emission Tomography,PET)等，但這些方法普遍腦損傷偏大或時(shí)間空間分辨率偏低的缺點(diǎn)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的雙光子激光共聚焦顯微鏡(Two-photon Laser Scanning Microscope，TPLSM)在一定程度上有效地克服了上述缺點(diǎn)，成為腦成像研究的重要工具。

雙光子激光共聚焦顯微鏡結(jié)合了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和雙光子激發(fā)技術(shù)[3]。其中雙光子激發(fā)技術(shù)是基于當(dāng)熒光基團(tuán)吸收相同兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光子照射后，經(jīng)過(guò)極短的一段時(shí)間，會(huì)發(fā)射出一個(gè)短波長(zhǎng)的光子，效果和單純吸收一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的短波長(zhǎng)的光子對(duì)其的激發(fā)效果完全一樣的原理[4-5]。在這個(gè)過(guò)程中涉及到的物理背景復(fù)雜，并不能理解為單純將某個(gè)光子的波長(zhǎng)擴(kuò)大一倍就成為長(zhǎng)波長(zhǎng)光子，所以說(shuō)雙光子技術(shù)的出現(xiàn)提供了新的，可供選擇的成像方法[6]。相較于目前一些使用清醒動(dòng)物作為模型采取雙光子進(jìn)行成像的實(shí)驗(yàn)方法，本實(shí)驗(yàn)中采取的方法相對(duì)保守，對(duì)麻醉后的活體動(dòng)物的腦組織注射Ca2+敏感熒光染料而后進(jìn)行雙光子觀察和記錄。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與試劑 昆明小鼠數(shù)只，年齡在20～30 d(購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；低融點(diǎn)瓊脂糖(Amresco公司)；人工腦脊液(ACSF，自配)；烏拉坦(150 mg/mL)；SPS緩沖液(150 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L KCl和10 mmol/L HEPES)；0.2的F-127溶于二甲亞砜(Sigma公司)； Sulforhodamine 101(SR101，Sigma公司)；具有膜滲透性的鈣指示劑(Oregon Green 488 BAPTA-1-AM，Invitrogen公司)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 手術(shù)器械(包括剪刀，細(xì)口鑷，棉簽，吸耳球，一次性吸液管)；CMA/450 動(dòng)物恒溫控制器；小鼠腦立體定位儀或固定器(淮北正華精密儀器有限公司)；牙科用吊磨機(jī)及微鉆頭；玻璃注射電極；顯微操作儀(可注射)(如SUTTER公司 MP-85型)；雙光子激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV 1000MPE，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所公共開放平臺(tái)提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麻醉動(dòng)物 用150 mg/mL的烏拉坦對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射(按照每10 g 體質(zhì)量0.1 mL的劑量)麻醉，將麻醉后的小鼠水平放置在保溫板上并用腦立體定位儀進(jìn)行固定，調(diào)節(jié)溫度使其恒定在37 ℃。

1.2.2 定位 使用鼠腦腦立體定位儀并參照小鼠腦定位圖譜對(duì)要觀測(cè)的腦區(qū)進(jìn)行定位[7]，以確定開顱位置(也可在開顱后按腦血管位置進(jìn)行定位，本實(shí)驗(yàn)中即采用這種方法)。在待開顱區(qū)域皮下注射50 mg/mL的烏拉坦進(jìn)行局部麻醉。

1.2.3 開顱前準(zhǔn)備 用剃須刀剃去小鼠待觀測(cè)區(qū)域頭皮上的毛發(fā)，剪去頭皮，剔除覆蓋在頭骨上的筋膜，暴露頭骨，在開顱前保持待頭骨的濕潤(rùn)(可用棉簽蘸取ACSF)。

1.2.4 開顱 用電鉆小心按圓形輪廓打磨待觀察區(qū)域頭骨。待頭骨邊緣呈半透明狀態(tài)后輕輕按壓頭骨，觀察到其邊緣軟化即可停止，用尖端極細(xì)的鑷子小心從邊緣夾取頭骨邊緣將其輕輕剝離開來(lái)[8]。在這個(gè)過(guò)程中，務(wù)必要保持操作上的準(zhǔn)確無(wú)誤，避免流血，很小的震蕩都會(huì)引起腦組織的損傷，從而影響成像。

1.2.5 配制及注射染料 將Oregon Green 488 BAPTA-1 AM溶解于F-127中，使其濃度保持在10 mmol/L。然后按0.4 μL(OG-1 AM)，0.5 μL(SR101)和4 μL(SPS)配成染料。使用玻璃電極配合微操作臂以45°角將染料按不同深度(100～400 μm)注射進(jìn)入腦組織，每次給藥量在0.05～0.1 μL之間，采用多點(diǎn)注射，使染料在腦組織中連成片，在選取注射點(diǎn)時(shí)要盡量避開血管，緩慢注射，一般2～3 min/次。注射完成后用一次性滴液管制作塑料小帽并用牙科水泥粘附頭骨上，暴露待觀察位置。在腦組織外滴加低熔點(diǎn)瓊脂糖覆蓋，防止其干燥。1 h后待染色完成后放置在雙光子激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.6 雙光子觀測(cè) 為便于成像，需要選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中染料對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)是809 nm,激光強(qiáng)度至少要達(dá)到50～70 mW，但不能過(guò)高，否則會(huì)加速熒光的淬滅[3]。樣本觀察觀察深度為100～400 μm。觀察前首先要在熒光下確定觀察區(qū)域，在40倍熒光鏡下，染色的區(qū)域和周圍的血管應(yīng)該清晰可見(jiàn)，激光照射下，可清楚看到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和普通神經(jīng)元細(xì)胞，在此種情況下，可觀察并測(cè)量單個(gè)或一群神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化，從而反映動(dòng)作電位水平的變化。

1.3 圖像記錄和處理

保存掃描得到的圖像和數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin8.0進(jìn)行歸一化處理。

結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 位于小鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層下200～300 μm的神經(jīng)元(黑色箭頭標(biāo)示)

圖2 位于小鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層下150 μm的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(白色箭頭標(biāo)示)

2 討 論

多數(shù)活體動(dòng)物的腦部成像與記錄的方法，往往存在難度大，易損傷，低分辨率和觀察時(shí)間短的問(wèn)題[9]。雙光子激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用很好的解決了上述問(wèn)題，由于神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+水平變化和電位變化密切相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)合Ca2+敏感染料對(duì)小鼠腦部結(jié)構(gòu)進(jìn)行雙光子成像的觀察。試驗(yàn)結(jié)果較好，既能夠得到相對(duì)高分辨率的圖像，又可以通過(guò)Ca2+敏感染料的特性記錄到神經(jīng)元快速發(fā)放的電活動(dòng)。在實(shí)驗(yàn)中要盡量避免待觀察腦區(qū)部位出現(xiàn)大量出血現(xiàn)象，過(guò)量流血會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的活性近而影響成像效果[10]，在記錄神經(jīng)元的Ca2+信號(hào)時(shí)，還要注意減少樣本整體的機(jī)械振動(dòng)，如在活體成像時(shí)，活體動(dòng)物的呼吸和心跳往往是較大的干擾源，所以，控制好機(jī)械振動(dòng)，也是獲得穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。另外，本實(shí)驗(yàn)選擇了與乙酰羥甲基酯(acetoxymethyl,AM)相結(jié)合的染料來(lái)給神經(jīng)元進(jìn)行染色，乙酰羥甲基酯易于通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，在進(jìn)入細(xì)胞后即被非特異性酯酶水解，留在細(xì)胞內(nèi)的熒光探針與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合發(fā)揮作用[11]。

同傳統(tǒng)激光共聚焦成像的方法相比，雙光子成像具有許多優(yōu)點(diǎn)：① 長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光的透射性更強(qiáng)，能更少地減少焦平面以外的熒光分子的激發(fā)，故能掃描到樣本平面以下更深的區(qū)域[12]。② 長(zhǎng)波長(zhǎng)激光有近紅外光的特性，在造成光毒性方面較紫外光和可見(jiàn)光要小很多。③ 更低的光漂白率：雙光子顯微鏡的光源由于散射性比較小，所以只在觀察的焦平面上才有光漂白和光毒性[13]，所以利用雙光子顯微鏡可以對(duì)樣本進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察。雙光子顯微鏡比單光子顯微鏡更適合用來(lái)觀察比較厚的樣本和活細(xì)胞活，或進(jìn)行定點(diǎn)光漂白實(shí)驗(yàn)。上述優(yōu)點(diǎn)為觀察大面積深部腦組織形態(tài)的可能性提供了理論依據(jù)。

雙光子激光共聚焦顯微鏡的另一個(gè)的另一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)就是：在圖像的時(shí)間和空間分辨率均有明顯的提高，由于能集中在小物體上進(jìn)行激發(fā)光的散射，所以在較小物體的成像中這種分辨率的提高尤為明顯，可以利用它來(lái)進(jìn)行各種細(xì)胞水平上的在體和體外的成像，尤其是可以對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)動(dòng)力學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察，如Ca2+信號(hào)變化的觀察和電生理的觀察。運(yùn)用這些方法得到的對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的快速變化和高分辨率的圖像是過(guò)去的技術(shù)所不及的。目前，本研究所正專注于對(duì)嗅覺(jué)系統(tǒng)與嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)腦內(nèi)投射[14]的高級(jí)功能的研究，雙光子顯微鏡技術(shù)以及其在活體成像記錄上的優(yōu)點(diǎn)為研究復(fù)雜嗅覺(jué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能提供了一種新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]WILSON J M,BROWNSTONE R M,DOMBECK D A,et al. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse [J]. J Neurophysiol,2007,97(4): 3118-3125.

[2]譚湘萍,梁碧玲,鐘鏡聯(lián)，等. 正常人腦組織磁共振擴(kuò)散張量成像[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2002，S1:80-82.

[3]GARASCHUK O,MILOS R I,KONNERTH A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo [J]. Nat Protoc,2006,1(1):380-386.

[4]STOSIEK C,GARASCHUK O,HOLTHOFF K,et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(12):7319-7324.

[5]STUTZMANN G E,LAFERLA F M,PARKER I. Ca2+signaling in mouse cortical neurons studied by two-photon imaging and photoreleased inositol triphosphate [J]. J Neurosci.,2003,23(3):758-765.

[6]SASAKI T,TAKAHASHI N,MATSUKI N,et al. Fast and accurate detection of action potentials from somatic calcium fluctuations [J]. J Neurophysiol,2008,100(3):1668-1676.

[7]MOSTANY R,PORTERA-CAILLIAU C. A Craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging [J] . J Vis Exp,2008(12):680. doi: 10.3791/680.

[8]GEIGER B M,FRANK L E,CALDERA-SIU A D,et al. Survivable stereotaxic surgery in rodents [J]. J Vis Exp,2008(12): 680. doi: 10.3791/680.

[9]GHOZLAND S,AGUADO F,ESPINOSA-PARRILLA J F,et al. Spontaneous network activity of cerebellar granule neurons: impairment by in vivo chronic cannabinoid administration[J]. Eur J Neurosci,2002,16(4):641-651.

[10] HELMCHEN F,BORST J G,SAKMANN B. Calcium dynamics associated with a single action potential in a cns presynaptic terminal [J] Biophys J,1997,72(3):1458-1471.

[11]陳同生,曾紹群,駱清銘,等.活體細(xì)胞內(nèi)雙光子激發(fā)的光漂白特性[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002,29(2):261-266.

[12]POWER J M,SAH P. Intracelluar calcium store filling by an L-type calcium current in the basolateral amygdala at subthreshold membrance potentials [J]. J Physiol,2005,562(pt2):439-453.

[13]KOESTER H J,SAKMANN B. Calcium dynamics associated with action potentials in single nerve terminals of pyramidal cells in layer 2/3 of the young rat neocortex [J].J Physiol,2000,529(3):625-646.

[14]項(xiàng)輝,彭波. 觸角嗅覺(jué)神經(jīng)束路示蹤的賴氨酸鈷填充方法 [J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002,41(3): 56-59.