交叉酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS分析重組蛋白二硫鍵分布的方法建立*

徐祖敏，程 銳，楊 霞，楊中漢，劉少軍，黎明濤，蔡衛(wèi)斌，高國(guó)全

(1. 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣東 廣州 510080；2.中山醫(yī)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080)

二硫鍵是肽鏈內(nèi)或肽鏈間兩個(gè)半胱氨酸的巰基氧化而成的共價(jià)鍵，主要參與維持蛋白質(zhì)分子的天然構(gòu)象、保持及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性與穩(wěn)定性[1]。目前常用的蛋白質(zhì)二硫鍵定位方法主要包括X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法、多維核磁共振波譜法(NMR)、對(duì)角線法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法和酶解法等。X射線晶體衍射法是確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法，但依賴于純蛋白高度有序結(jié)晶的形成。NMR的特點(diǎn)是在近似自然生理?xiàng)l件的溶液狀態(tài)下測(cè)出較小蛋白質(zhì)的構(gòu)象。上述兩種方法進(jìn)行二硫鍵研究時(shí)的缺點(diǎn)在于：要求樣品量比較大，一些柔性的蛋白質(zhì)不易得到所需的晶體，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白的計(jì)算處理和解譜非常復(fù)雜。而對(duì)角線法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法和酶解法等，則存在操作繁瑣，分析復(fù)雜等缺點(diǎn)，應(yīng)用受到限制[2]。隨著質(zhì)譜儀器在分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)速度等方面的發(fā)展和提高，質(zhì)譜法更加適合用于蛋白質(zhì)和多肽結(jié)構(gòu)與功能的研究，并應(yīng)用于二硫鍵的定位分析。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF/MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高且簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段。MALDI-TOF/MS是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比(m/z)的不同來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量。相對(duì)分子質(zhì)量正確與否往往代表著所測(cè)定的有機(jī)化合物及生物大分子的結(jié)構(gòu)正確與否。MALDI-TOF/MS測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%～0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS-PAGE電泳與高效凝膠色譜技術(shù)。理論上，MALDI-TOF/MS技術(shù)如能準(zhǔn)確測(cè)定出非還原狀態(tài)二硫鍵連接肽段和還原狀態(tài)肽段的相對(duì)分子質(zhì)量，進(jìn)行肽段相對(duì)分子質(zhì)量匹配分析，應(yīng)能確定蛋白質(zhì)中二硫鍵的分布信息。

本研究以Kringle環(huán)作為分子模型，以MALDI-TOF/MS聯(lián)合特異性蛋白酶酶切為技術(shù)手段，探討建立蛋白質(zhì)二硫鍵分布和定位分析的研究方法。Kringle環(huán)是存在于多種蛋白質(zhì)分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)模體，如纖溶酶原激活因子、凝血酶原、纖溶酶原、載脂蛋白a及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[3]。Kringle環(huán)由80個(gè)氨基酸殘基組成，包含6個(gè)半胱氨酸，并按照1-6，2-4，3-5的方式形成3個(gè)二硫鍵，從而維持獨(dú)特的聯(lián)環(huán)狀Kringle結(jié)構(gòu)。研究者采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出含單個(gè)Kringle環(huán)的重組人纖溶酶原K5多肽(rhK5)[4-5]，并分析該多肽的血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制活性[6-7]，為明確重組K5多肽中二硫鍵的形成以及6個(gè)Cys能否正確配對(duì)連接，進(jìn)一步采用了高度特異性的質(zhì)譜分析級(jí)胰蛋白酶(Trypsin Gold,Mass Spectrometry Grade)和蛋白內(nèi)切酶Asp-N(Endoproteinase Asp-N)交叉酶切的方式，獲取重組K5多肽理論上包含單個(gè)二硫鍵的特定肽段，并用MALDI-TOF/MS分別測(cè)定和配對(duì)酶切片段相對(duì)分子質(zhì)量和還原后片段的相對(duì)分子質(zhì)量，判斷酶切片段中是否存在二硫鍵。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

pET22b(+)質(zhì)粒、E.coliBL21 (DE3)表達(dá)菌株和Ni2+His Bind Resin為Novagen公司產(chǎn)品；EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ購(gòu)自Takara公司；IPTG為鼎國(guó)公司產(chǎn)品；His-tag鼠源性單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Vector公司；質(zhì)譜分析級(jí)Trypsin Gold購(gòu)自Promega公司；Endoproteinase Asp-N購(gòu)自Roche Diagnostic公司；三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、醋酸、磷酸三氯乙酯等為廣州化學(xué)試劑廠分析純；乙腈、三氟醋酸、α-氰-4-羥基肉桂酸等為Sigma公司產(chǎn)品；ZipTip微量固相萃取吸嘴購(gòu)自Millipore公司；凝膠成像系統(tǒng)為GENE GENIUS公司產(chǎn)品，真空凍干機(jī)為Virtis公司產(chǎn)品，MALDI-TOF/MS質(zhì)譜儀為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品，JASCO-J-810圓二色譜儀為日本分光公司產(chǎn)品。

1.2 rhK5的表達(dá)純化

以K5全長(zhǎng)cDNA為模板用PCR的方法擴(kuò)增人纖溶酶原Kringle 5基因，在EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ處將其克隆進(jìn)表達(dá)載體pET22b(+)中，DNA測(cè)序鑒定其連接正確； pET22b(+)/K5轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coliBL21 (DE3)中。IPTG 25 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)12h，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)固化Ni2+His Bind Resin親和層析純化，所得重組蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western-blot方法分析鑒定，I抗為抗His-tag鼠源性單克隆抗體，II抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG。

1.3 rhK5蛋白對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制活性

人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定參照本研究組前期研究報(bào)道[9]，活體眼組織來(lái)源于中山大學(xué)中山眼科中心。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×105/mL接種到24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至約80%細(xì)胞融合度時(shí)用rhK5處理，各組終濃度分別為5、10、20、40、80 nmol/L，陰性對(duì)照組為等量無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后終止處理。細(xì)胞的增殖狀態(tài)采用噻唑蘭顏色反應(yīng)法(MTT法)檢測(cè)[9]。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%=100-OD處理組/OD陰性對(duì)照組×100%)，作為判斷rhK是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制活性的指標(biāo)。

1.4 rhK5一級(jí)結(jié)構(gòu)與二硫鍵分布的生物信息學(xué)分析

野生型人纖溶酶原K5的氨基酸序列從數(shù)據(jù)庫(kù)http://genome.ucsc.edu/中查找pET22b(+)/BL21(DE3)原核系統(tǒng)表達(dá)的rhK5蛋白N-末端包含信號(hào)肽殘余氨基酸序列，C-端會(huì)保留載體的部分序列及6×His標(biāo)簽。rhK5一級(jí)結(jié)構(gòu)正確與否主要通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量分析來(lái)驗(yàn)證：采用蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT 4.3(Institute of Biology and Chemistry of Proteins，F(xiàn)rance)依據(jù)推測(cè)氨基酸序列計(jì)算其理論相對(duì)分子質(zhì)量；采用MALDI-TOF/MS精確測(cè)定其實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量。根據(jù)實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量和理論相對(duì)分子質(zhì)量之間的差異判斷重組蛋白推測(cè)氨基酸序列是否正確(MALDI-TOF的準(zhǔn)確度極高，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量MALDI-TOF-MS測(cè)定值之間差異不超過(guò)0.1%～0.01%)。

采用3D-JIGSAW蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Cancer Research UK London Research Institute,UK,http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/)對(duì)rhK5二硫鍵分布進(jìn)行生物信息學(xué)分析。3D-JIGSAW是以已知結(jié)構(gòu)域的類(lèi)比為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的服務(wù)器，特別適合于序列長(zhǎng)度適中、序列復(fù)雜程度不高且沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。rhK5預(yù)測(cè)結(jié)果用RasTop軟件分析，獲得其三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖和二硫鍵的空間位置分布，初步分析rhK5二硫鍵和Kringle結(jié)構(gòu)域的形成情況。

1.5 rhK5的單酶切和交叉酶切

單酶切：將純化的rhK5蛋白用真空凍干機(jī)制成蛋白凍干粉，后用500 μL酶切緩沖液(50 mM Tris-Cl,1 mmol/L CaCl2，pH 7.6)溶解，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取100 μL蛋白溶液，加入一定量Trypsin Gold(質(zhì)量比1∶50)，37 ℃水浴16 h。交叉酶切：在Trypsin Gold單酶切后的混合物中加入一定量的Endoproteinase Asp-N(質(zhì)量比1:20),37 ℃水浴8 h。單酶切或雙酶切完成后，將酶切后的混合物分成兩等分，一份備用，另一份加入約3 μL磷酸三氯乙酯，60 ℃水浴約10 min。將此混合溶液(包括非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)的蛋白質(zhì))經(jīng)真空冷凍干燥制成蛋白凍干粉，并經(jīng)ZipTip pipette脫鹽濃縮后，與基質(zhì)(α-氰-4-羥基肉桂酸)1:1均勻混合，混合物直接用于MALDI-TOF/MS分析。

1.6 rhK5空間結(jié)構(gòu)的圓二色譜分析

取上述親和層析方法純化的rhK5蛋白用25 mmol/L 硼酸溶液(pH 7.4)透析8 h后，于JASCO-J-810圓二色譜儀在25 ℃恒溫下測(cè)量其CD譜(185～260 nm)，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用25 mmol/L 硼酸溶液(pH7.4)作為空白對(duì)照，偏振值掃描時(shí)蛋白的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

2 結(jié) 果

2.1 rhK5的表達(dá)純化及初步鑒定

IPTG 25 ℃低溫誘導(dǎo)BL21(DE3)/pET22b(+)/K5重組菌表達(dá)，細(xì)菌裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并用考馬斯亮蘭染色分析顯示(圖1a)：IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解產(chǎn)物在13 000處有明顯蛋白表達(dá)。將上述蛋白提取液與Ni2+-His Bind Resin在4 ℃攪拌混合后，通過(guò)親和層析純化含有6個(gè)His-tag的重組蛋白，可獲得高純度可溶性蛋白rhK5。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果顯示純化后重組蛋白純度可達(dá)95%。重組蛋白用抗His-tag抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，顯示有明顯的免疫雜交帶(圖1b)。

圖1 重組人纖溶酶原kringle 5蛋白的表達(dá)、純化及鑒定

2.2 rhK5抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖

圖2結(jié)果顯示，與對(duì)照組(rhK5濃度為0 nmol/L，即未加rhK5組)相比，rhK5能明顯抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在濃度為20 nmol/L時(shí)即有抑制作用(P<0.05)，當(dāng)濃度達(dá)40 nmol/L時(shí)，差異具有顯著意義(P<0.01)。這種對(duì)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用隨著rhK5濃度的增大而增加，存在明顯的濃度依賴關(guān)系。

圖2 重組人纖溶酶原kringle 5蛋白抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖

2.3 rhK5一級(jí)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

根據(jù)pET22b(+)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和目的基因插入位點(diǎn)分析，rhK5蛋白的N-末端包含信號(hào)肽殘余氨基酸序列(NH2-MDIGINSDPNS-COOH)，C-端會(huì)保留載體的部分序列及6×His標(biāo)簽(NH2-KlAAALEHHHHHH-COOH)。推測(cè)rhK5一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)如圖3A所示，并依據(jù)此序列采用蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT 4.3計(jì)算出rhK5蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別為12 834.08。SDS-PAGE電泳圖譜顯示(圖1)，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)相比，區(qū)帶位置與理論計(jì)算值一致。進(jìn)一步采用MALDI-TOF/MS精確測(cè)定rhK5蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別為12 826.70(見(jiàn)圖3B)。SDS-PAGE和MALDI-TOF/MS相對(duì)分子質(zhì)量分析數(shù)據(jù)證實(shí)預(yù)測(cè)的K5及其突變體重組蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)是正確的。

圖3 重組人纖溶酶原kringle 5蛋白的氨基酸序列示意圖及其相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

2.4 rhK5空間結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

登錄3D-JIGSAW蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw 將rhK5氨基酸序列輸入后，進(jìn)行氨基酸序列分析和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，應(yīng)用RasTop Version 2.1軟件獲得目標(biāo)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖并標(biāo)示二硫鍵。分析結(jié)果顯示(圖4)：采用原核表達(dá)體系獲得的rhK5蛋白能進(jìn)行正確空間折疊，蛋白分子中的半胱氨酸能進(jìn)行正確配對(duì)連接形成3個(gè)二硫鍵，分別為Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536，這與野生型K5完整Kringle結(jié)構(gòu)域形成方式一致。

圖4 重組人纖溶酶原kringle 5蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)示意圖

2.5 交叉酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS分析rhK5蛋白二硫鍵分布及Kringle結(jié)構(gòu)完整性

在利用生物信息學(xué)的方法初步論證rhK5蛋白空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，采用交叉蛋白酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS進(jìn)一步分析二硫鍵定位與分布。研究中所用Trypsin Gold特異性切割位點(diǎn)在Lys(K)和Arg(R)的羧基側(cè)，內(nèi)蛋白酶-ASP-N特異性切割位點(diǎn)在X(氨基酸殘基)-D(Asp)的氨基側(cè)。

如表1所示，rhK5蛋白經(jīng)Trypsin Gold消化后，理論上可以得到包含二硫鍵Cys483:524的預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量為3 916.20(用ANTHEPROT 4.3推算)的肽段，用MALDI-TOF/MS分析rhK5Trypsin Gold消化產(chǎn)物，證實(shí)存在精確相對(duì)分子質(zhì)量為3 916.773多肽，即為目標(biāo)肽段(圖5 A1)；采用TCEP充分還原rhK5 Trypsin Gold消化產(chǎn)物后，MALDI-TOF/MS圖譜顯示相對(duì)分子質(zhì)量為3 916.773的肽段消失，僅見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量2 069.662及1 848.488的兩個(gè)片段(圖5 A2)，由此說(shuō)明在rhK5蛋白的Cys483與Cys524間存在一個(gè)二硫鍵。

rhK5 蛋白經(jīng)Trypsin Gold和內(nèi)蛋白酶-ASP-N聯(lián)合酶切產(chǎn)物在非還原狀態(tài)和還原狀態(tài)下的MALDI-TOF/MS圖譜以類(lèi)似的方法證實(shí)了另外兩個(gè)二硫鍵Cys462:541和Cys512:536的正確形成(圖5 B1和B2)，從而說(shuō)明K5蛋白空間結(jié)構(gòu)正確和Kringle結(jié)構(gòu)完整。

表1 重組人纖溶酶原kringle5經(jīng)Trypsin和/或endoproteinase Asp-N后的蛋白片段

The molecular weights of the peptide fragment were calculated according to their amino acid sequence with the software of ANTHEPROT 4.3

2.6 rhK5空間結(jié)構(gòu)的圓二色譜分析

純化的rhK5蛋白，在JASCO-J-810圓二色譜儀上經(jīng)185～260 nm遠(yuǎn)紫外線掃描顯示，在約230 nm附件出現(xiàn)一個(gè)最大負(fù)峰，為典型的β折疊型結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。

3 討 論

根據(jù)重組體構(gòu)建的原理和人纖溶酶原的氨基酸序列，本研究首先分析了rhK5氨基酸序列，并進(jìn)一步比較通過(guò)蛋白序列分析軟件包ANTHEPROT 4.3獲得的理論相對(duì)分子質(zhì)量和通過(guò)MALDI-TOF/MS精確測(cè)定實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量之間的一致性，從而證明重組蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的正確和符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；在一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列基礎(chǔ)上采用生物信息學(xué)的方法(3D-JIGSAW蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù))預(yù)測(cè)了重組蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示了目標(biāo)蛋白的空間結(jié)構(gòu)符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

生物信息學(xué)分析能初步說(shuō)明rhK5蛋白中Cys的正確配對(duì)和Kringle結(jié)構(gòu)完整與否。更有說(shuō)服力的證據(jù)需要客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究采用交叉蛋白酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS法對(duì)基因工程重組蛋白二硫鍵的定位和形成進(jìn)行客觀分析。應(yīng)用Trypsin Gold單獨(dú)酶切或Trypsin Gold與Endoproteinase Asp-N交叉酶切的方式，消化rhK5蛋白產(chǎn)生的目的片段及其對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量如表1所示。完整的rhK5或酶切后的rhK5，經(jīng)MALDI-TOF/MS分析得到質(zhì)譜圖。如圖3所示，完整rhK5的相對(duì)分子質(zhì)量為12 826.70，這與預(yù)測(cè)的rhK5相對(duì)分子質(zhì)量12 834.08相符(誤差<0.1‰)。經(jīng)單酶切的rhK5，在非還原狀態(tài)下可見(jiàn)3 916.7峰(圖5:A1)，在還原狀態(tài)下該峰消失，而出現(xiàn)2069.6和1848.4這兩個(gè)峰(圖5.A2)，由此可證明Cys483-Cys524的存在。經(jīng)雙酶切的rhK5，在非還原狀態(tài)下可見(jiàn)2441，1628和951這三個(gè)峰(圖5.B1)，而在還原狀態(tài)下這三個(gè)峰皆消失(圖5.B2)，由此可證明K5中的六個(gè)半胱氨酸按Cys483-Cys524,Cys462-Cys541及Cys512-Cys536的連接方式形成了3個(gè)二硫鍵。圓二色譜分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)rhK5的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β折疊，其結(jié)果與前期對(duì)Kringle結(jié)構(gòu)域研究的結(jié)果一致[8-10]，提示其正確地折疊形成了的空間結(jié)構(gòu)。文中對(duì)rhK5蛋白進(jìn)行生物活性的研究表明rhK5正確地折疊形成了具有生物活性的空間構(gòu)象。

圖5 基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析重組人纖溶酶原kringle 5的二硫鍵分布

圖6 圓二色譜法分析重組人纖溶酶原kringle 5的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

相對(duì)分子質(zhì)量是有機(jī)化合物最基本的理化性質(zhì)參數(shù)，相對(duì)分子質(zhì)量正確與否往往代表著所測(cè)定的有機(jī)化合物及生物大分子的結(jié)構(gòu)正確與否。本研究方法的主要理論依據(jù)在于MALDI-TOF/MS法能夠精確的測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，準(zhǔn)確度高達(dá)0.1%～0.01%，在這種精確度下，蛋白質(zhì)與相對(duì)分子質(zhì)量之間存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，在研究中我們也能很容易地根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量判斷對(duì)應(yīng)的肽段，以及根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的變化分析肽段的變化[11-12]。交叉蛋白酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS法相對(duì)其他生物結(jié)構(gòu)分析方法的優(yōu)點(diǎn)在于：方法簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短，省時(shí)、成本低、實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀，易于分析、數(shù)據(jù)具有說(shuō)服力。

綜上所述，本研究采用交叉蛋白酶切聯(lián)合MALDI-TOF/MS法證實(shí)了rhK5分子中各Cys均是正確配對(duì)連接的。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了關(guān)于rhK5重組蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸序列推測(cè)、相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)算和空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)都是正確的；同時(shí)，它還說(shuō)明在原核表達(dá)體系獲得的rhK5蛋白形成了完整的Kringle結(jié)構(gòu)域。這為進(jìn)一步深入地研究Kringle結(jié)構(gòu)與rhK5的功能關(guān)系奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究從新的角度、采用新的技術(shù)手段建立分析蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的位置和分布的研究方法，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、高效易操作等特點(diǎn)。

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