快速毛細(xì)管電泳安培法測(cè)定京尼平甘和藏紅花素的含量*

黃寶美，姚程煒，莫金垣，邊清泉，王志國(guó)

(1.綿陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)系，四川 綿陽(yáng)621000；2.中國(guó)空氣動(dòng)力研究與發(fā)展中心設(shè)備設(shè)計(jì)及測(cè)試技術(shù)研究所，四川 綿陽(yáng)622653；3.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

梔子Fructusgardeniae又名黃梔子、梔子花、山梔、水黃梔等，味苦性寒，具有抗氧化、降血脂、降血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗焦慮等作用[1]。其主要活性成分有京尼平苷(Geniposide)和藏紅花素(Crocin)。京尼平甘別名梔子苷具有緩瀉、鎮(zhèn)痛、利膽、抗炎、治療軟組織損傷以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用。藏紅花素可以增加膽汁分泌量，能顯著的抗致癌物，并已有以此開(kāi)發(fā)新藥的嘗試。 梔子資源豐富,作為提取京尼平苷和藏紅花素的原料是很有價(jià)值的。

圖1 京尼平苷和藏紅花素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前對(duì)于梔子成分的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2-6]。毛細(xì)管電泳法有柱效高，分離速度快，試劑和樣品消耗少，成本低，精密度高等優(yōu)點(diǎn)在中草藥及其制劑的分析中有著高效液相色譜無(wú)法企及的優(yōu)點(diǎn)。王洪平，李利君等[7-8]用毛細(xì)管電泳光檢測(cè)法對(duì)梔子中的主要成分進(jìn)行了測(cè)定，目前尚未見(jiàn)電化學(xué)檢測(cè)其活性成分的報(bào)道，電化學(xué)檢測(cè)法與光化學(xué)檢測(cè)相比，電化學(xué)檢測(cè)器可以自己組裝，經(jīng)濟(jì)實(shí)用,光化學(xué)檢測(cè)器比較昂貴；電化學(xué)檢測(cè)也可以避免毛細(xì)管光程短，靈敏度低的缺點(diǎn)；電化學(xué)檢測(cè)器中的安培檢測(cè)選擇性高，受干擾小，特別適合中草藥等實(shí)際樣品的分離分析[10]。本文采用電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)梔子中的藏紅花素和京尼平苷進(jìn)行了分離檢測(cè)，相對(duì)于液相色譜法，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

CL1010型高效毛細(xì)管電泳儀，CL101A型高壓電源，(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)，碳纖維電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極。

磷酸二氫鈉，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，硼砂，氫氧化鈉，鹽酸，甲醇，以上試劑均為分析純；所用水為蒸餾水。

1.2 對(duì)照品溶液，樣品溶液和緩沖溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 各準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的京尼平甘和藏紅花素對(duì)照品，用φ=50%甲醇溶解后定容至25.00 mL，得到對(duì)照品溶液500 mg/L和400 mg/L。再取2 mL溶液稀釋20倍待用。分別取稀釋后的溶液配制成1+1，1+4，1+10，1+20，1+50，1+100，1+200等一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線備用。

1.2.2 樣品溶液的制備 稱(chēng)取梔子粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.20 g，精密稱(chēng)量，置于50 mL錐形瓶中，加入φ=50%甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲20 min，放涼，補(bǔ)重，過(guò)濾后精密量取1 mL至25 mL容量瓶中，以φ=50%甲醇定容，搖勻，得樣品溶液[9]。

1.2.3 緩沖溶液的制備 分別制備100 mmol/L的硼砂，磷酸二氫鈉， 檸檬酸鈉，Tris，NaOH，HCl的儲(chǔ)備液，各取適量配成不同濃度比的體系(具體配置見(jiàn)分析化學(xué)手冊(cè))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

進(jìn)樣前，毛細(xì)管依次用0.1 mol/L的鹽酸、二次蒸餾水和緩沖溶液各沖洗約10 min，每2次進(jìn)樣之間用緩沖液沖洗3 min，以保證其重現(xiàn)性。采用重力進(jìn)樣方式，進(jìn)樣高度20 cm，時(shí)間8 s，分離毛細(xì)管長(zhǎng)度45 cm，內(nèi)徑50 μm，分離電壓25 kV，工作電極電位0.86 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作電位的選擇

工作電位的選擇直接影響到實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度、檢出限和穩(wěn)定性,在電化學(xué)工作站上考察了京尼平苷和藏紅花素的循環(huán)伏安圖(如圖2(A)所示)，發(fā)現(xiàn)京尼平苷和藏紅花素在碳糊電極，微Pt電極上都沒(méi)有響應(yīng)，在碳纖維電極上有響應(yīng)，從圖2可以看上京尼平苷在1.0 V左右出現(xiàn)一個(gè)不可逆的氧化峰，藏紅花素在0.85 V左右出現(xiàn)一個(gè)不可逆的氧化峰。

在毛細(xì)管電泳儀上考察了京尼平甘和藏紅花素的動(dòng)態(tài)伏安(圖2(B)所示)，考察了工作電位0.20 ～ 1.05 V對(duì)峰電流的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著工作電位的增加，峰電流增大，當(dāng)工作電位大于0.86 V時(shí)，峰電流又有所降低，考慮靈敏度和檢出限，選擇檢測(cè)電位為+0.86 V。

圖2 京尼平苷(a)和藏紅花素(b)的循環(huán)伏安圖(A)和動(dòng)態(tài)伏安圖(B)分離高壓：25 kV；毛細(xì)管: 50 μm ×45 cm； 緩沖溶液：tris-HCl，pH=8.50；虹吸進(jìn)樣:20 cm；

2.2 緩沖溶液濃度的選擇

分別考察了NaOH-Na2B4O7·2H2O， Tris-HCl，硼砂-鹽酸，檸檬酸鈉-HCl，磷酸鹽5種不同緩沖體系對(duì)分離的影響。發(fā)現(xiàn)其中磷酸鹽緩沖溶液基線噪音和基線偏移都較大；檸檬酸鈉-HCl 和NaOH-Na2B4O7·2H2O 中不出峰；硼砂-鹽酸體系有雜峰；Tris-HCl緩沖溶液中比較穩(wěn)定，峰形較好。所以本實(shí)驗(yàn)選擇Tris-HCl緩沖溶液體系。配制了幾種不同濃度的緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度較大時(shí)，背景電流較大，噪音增大，基線漂移，濃度較小時(shí)，峰較寬，綜合考慮， 本實(shí)驗(yàn)選用20 mmol/L的Tris為緩沖溶液的濃度。

2.3 緩沖溶液pH的選擇

考察了緩沖溶液pH分別為4.96、7.61、8.50、8.89、11.04時(shí)，對(duì)電泳遷移時(shí)間和峰形的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH值增大，遷移時(shí)間減小，但柱效變低，綜合考慮峰形、遷移時(shí)間、柱效的影響，本文選擇溶液的pH=8.50。

2.4 分離高壓及進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離的影響

分離高壓是毛細(xì)管電泳的驅(qū)動(dòng)力。電壓越高，組分遷移越快，分析時(shí)間越短，但是電壓升高，使柱內(nèi)焦耳熱增加，易發(fā)生氣泡割斷現(xiàn)象，對(duì)工作電極也有一定影響。在一定范圍內(nèi)，柱效隨著電壓增大而增大，過(guò)了極點(diǎn)，隨著電壓升高，焦耳熱的影響更大，柱效反而降低。實(shí)驗(yàn)采用瞬間加壓的恒電壓工作方式，考察了(15～30 kV)高壓對(duì)遷移時(shí)間和柱效的影響，結(jié)果選擇電壓為25 kV。

采用虹吸進(jìn)樣，在一定進(jìn)樣高度下，進(jìn)樣時(shí)間決定進(jìn)樣量的多少，選擇進(jìn)樣高度為20 cm，考察了進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離檢測(cè)的影響。發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣時(shí)間太短，達(dá)不到檢測(cè)器的靈敏度,若進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)8 s，進(jìn)樣量增大，引起樣品擴(kuò)散，導(dǎo)致峰形擴(kuò)寬拖尾，故選擇進(jìn)樣時(shí)間為8 s。

2.5 方法的精密度和線性范圍

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，將京尼平甘和藏紅花素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣6次，遷移時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2 %和1.5 %。京尼平甘在0.25～50 mg/L范圍內(nèi)峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(c)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為:Y=22994.4+ 18718.5c,r=0.999 4，檢出限為0.1 mg/L。藏紅花素0.8～40 mg/L范圍內(nèi)峰面積(Y)與質(zhì)量濃度(c)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為:Y=10681.2 + 16738.4c,r=0.999 6，檢出限為0.2 mg/L。

2.6 樣品測(cè)定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在最佳條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的毛細(xì)管電泳圖如圖3所示。圖中主峰為京尼平甘和藏紅花素的峰，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中京尼平甘和藏紅花素的峰型和出峰時(shí)間基本一致，定性的說(shuō)明了片劑中的主峰為京尼平甘和藏紅花素的峰。按照本文“1.2”節(jié)方法制備樣品，用外標(biāo)法定量，平行測(cè)定5次，經(jīng)計(jì)算浙江梔子中京尼平苷和藏紅花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為26.51 mg/g和7.028 mg/g，四川梔子中京尼平甘和藏紅花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.46 mg/g和8.527 mg/g。并按照以上實(shí)驗(yàn)方法在1.2節(jié)制備樣品溶液時(shí)分別加入不同水平量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平量平行測(cè)定3次，測(cè)得浙江梔子中京尼平甘和藏紅花素的平均回收率分別為99.64%和100.2%，四川梔子中京尼平苷和藏紅花素的平均回收率分別為99.73%和99.90%。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)的毛細(xì)管電泳圖

表1 樣品的測(cè)定結(jié)果及回收率

Table 1 Analysis results and recovery ratios mg·g-1

樣品名稱(chēng)本底值增加量測(cè)定值回收率/%京尼平甘浙江梔子5.3025.00010.31100.21.5296.82599.610.67385.97099.12四川梔子6.4926.00012.50100.12.3908.887100.21.0027.48398.90藏紅花素浙江梔子1.4061.2062.618100.50.5721.983100.90.1411.54699.3四川梔子1.7051.1522.861100.30.5042.20398.80.1711.877100.6

3 結(jié) 論

本文采用快速毛細(xì)管電泳安培檢測(cè)法對(duì)浙江梔子和四川梔子中的藏紅花素和京尼平苷進(jìn)行了分離檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工作電位，緩沖溶液，分離高壓等條件，在優(yōu)化條件下，得到了較滿意的結(jié)果，可為藏紅花素和京尼平苷的含量測(cè)定提供新方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉國(guó)敏，郭素華，程維明. 梔子的藥理作用及其機(jī)制研究新進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2008，20 (11)：8-10.

[2]段啟,陳華師.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地梔子中藏紅花素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21(3)：299-301.

[3]胡震,王義明,羅國(guó)安,等.梔子藥材中三種有效成分HPLC定量分析結(jié)果不確定度的評(píng)定[J]. 中藥材,2005,28(11):991-994.

[4]徐燕,曹進(jìn),王義明,等.多波長(zhǎng)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定梔子中的三類(lèi)成分[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,38(7):543-546.

[5]王春芳,魯靜.高效液相色譜法測(cè)定梔子中藏紅花素的含量[J].藥物分析雜志,1997,17(5):321-323.

[6]李向陽(yáng),馮偉力,袁明,等.大鼠血漿中藏紅花素的HPLC法測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[J]. 青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,28(2):73-77.

[7]王洪平，周洪雷，李和光，等.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子中梔子苷的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志，2010,37(2)：318-319.

[8]李利軍,馮軍,黃文藝,等.高效毛細(xì)管電泳同時(shí)分離測(cè)定梔子苷、芍藥苷及丹皮酚的研究[J].分析試驗(yàn)室，2007,26(5)：38-41.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：173.

[10]黃寶美，杜世章，姚程煒，等. 高效毛細(xì)管電泳安培法測(cè)定麥冬中薯蕷皂甙元的含量[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010,49(2):65-67.