雙羥基脂肪酸異構(gòu)體的合成及譜學(xué)特征*

李 珍，楊得坡，COLIN DUKE，董文其

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物制藥系，廣東 廣州 510515；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.悉尼大學(xué)藥學(xué)院，NSW2006,澳大利亞)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一類天然來源的功能性脂肪酸，其主要的活性異構(gòu)體是9Z,11E-CLA和10E,12Z-CLA[1]。它們具有多種重要的生理功能，如抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力、減肥增肌、促進骨生長等[2]。近年來，尤其是CLA防癌抗癌方面的活性，備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。最新國外研究報道[3]，在雙鍵的鄰位引入羥基(-OH)基團，對抗腫瘤活性能起到一個增效的作用。因此，對其進行結(jié)構(gòu)修飾和改造，是開發(fā)新藥的一條重要研究途徑。本文采用一種快速，便捷的化學(xué)方法合成羥基脂肪酸，得到了4個新的雙羥基衍生物。通過對化合物的NMR和MS數(shù)據(jù)分析，揭示它們的化學(xué)位移變化規(guī)律和質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡明其譜學(xué)特征，為雙羥基脂肪酸異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

美國Finnigan公司Mat TSQ7000 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Palo Alto公司300 MHz Varian 核磁共振儀，美國Beckman公司半制備高效液相色譜儀。

共軛亞油酸甲酯(φ=95%)，為中山UNICARE公司生產(chǎn)；

叔丁基過氧化氫溶液(φ=70%)，二氧化硒，DMSO，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，鹽酸，無水硫酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學(xué)合成方法 在50 mL的圓底燒瓶中加入一定量的SeO2，10 mL 二氯甲烷和適量的TBHP溶液在一定溫度下攪拌半小時(600 r/min)，緩慢加入等摩爾比的共軛亞油酸甲酯,反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入φ=10% NaCl溶液洗滌2次，收集二氯甲烷層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去溶劑，即得到淡黃色的油狀物a。

1.2.2 分離純化方法 樣品溶液的配制：用正己烷將淡黃色的油狀物a溶解，配成濃度為100 mg/mL 的溶液供半制備色譜分析。半制備HPLC色譜條件： Alltech硅膠柱(250 mm×100 mm×10 μm)，流動相為正己烷/異丙醇(體積比為98/2)；流速8 mL/min；檢測器：示差折光檢測器；進樣量150 μL。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定方法 LCMS/MS分析:LCMS/MS(Finnigen/Mat TSQ7000)，Alltech ODS 毛細管柱(2.1 mm×150 mm)，流動相：40 min內(nèi)從φ=40%乙腈(φ=60%水；φ=0.5% 甲酸)變化到φ=100%乙腈(φ=0.5% 甲酸)。Bruker BioApex Fourier transform mass spectrometer ESI-MS。正離子ESI模式分析脂肪酸甲酯，負離子ESI模式分析脂肪酸。

1H NMR和13C NMR分析:300 MHz Varian Gemini 300 spectrometer NMR (Palo Alto California,USA)，試劑：CDCl3(Sigma-Aldrich,USA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)機制

本文首次將SeO2應(yīng)用于共軛亞油酸甲酯催化合成雙羥基脂肪酸甲酯，共軛亞油酸甲酯與SeO2反應(yīng)，其產(chǎn)物為：9,10(erythro)-雙羥基-11E-十八碳烯酸甲酯(3)，10,11(erythro)-雙羥基-12E-十八碳烯酸甲酯(4)，11,12(erythro)-雙羥基-9E-十八碳烯酸甲酯(5)和12,13(erythro)-雙羥基-10E-十八碳烯酸甲酯(6)，如圖1所示。

圖1 共軛亞油酸甲酯與SeO2的合成反應(yīng)

由于采用SeO2進行烯丙位加氧是一個經(jīng)典的方法[4]，本實驗最初的目的是用SeO2催化共軛亞油酸合成單羥基共軛亞油酸衍生物。令人感到意外的是，當CLA甲酯與SeO2/t-BuOOH 反應(yīng)24 h后，得到了Se的復(fù)合物，經(jīng)硅膠柱層析時進行水交換反應(yīng)，最后得到1，2-雙羥基脂肪酸衍生物。1H NMR數(shù)據(jù)顯示有兩組1,2-鄰氧的質(zhì)子共振位于δ4.81，4.45和4.28，3.96 處，過硅膠柱之后，這兩組峰的化學(xué)位移發(fā)生了變化，并重疊成一組峰于δ3.86,3.44 處。

經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)[5]，這是一類關(guān)于1,3-二烯與SeO2反應(yīng)產(chǎn)生1,2- 和1,4-二醇產(chǎn)物的新的反應(yīng)機理，因此推測該反應(yīng)的機理如圖2，并通過反應(yīng)產(chǎn)物得到了確認。

圖2 共軛亞油酸甲酯與SeO2的反應(yīng)機理

2.2 半制備HPLC 分離純化

分離結(jié)果如圖所示，通過收集峰1，2，3，峰1為兩個異構(gòu)體5，6的混合物，峰2和3為純度較高的化合物3，4(圖3)。

圖3 半制備-HPLC 分析結(jié)果

2.3 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定及譜學(xué)特征

2.3.1 LC-MS/MS分析 對的化合物3，4，5，6進行LC-MS/MS分析。對化合物甲酯用ESI(+)沒有得到分子離子峰，而得到了311 [M+1-H2O]+的碎片離子峰。由于化合物甲酯正離子信號很弱，無法得到更多的信息。因此對脂肪酸用ESI(-)模式，得到了各化合物的分子離子峰，如表1所示?；衔?，4，5，6是一組幾何異構(gòu)體,它們的出峰順序是6=5>4>3。

通過MS/MS(-)分析，得到各化合物的特征碎片離子m/z如下：

6∶313,295,277,213,183,129；5∶313,295,277,199,169,113；4∶313,295,277,215,185,127；3∶313,295,277,201,171,141。

表1 化合物的LC-MS/MS的分析結(jié)果

由此推測化合物的裂解機理如下

3：

4：

5：

6：

各個化合物1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)如下。

化合物(3)∶產(chǎn)率>98%,solid,θmp39～40 ℃。

1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ：5.76 (dt,J=15.4,6.0 Hz,1H,H-12),5.44 (ddt,J= 15.4,7.2,1 Hz,1H,H-11),3.86 (t,J= 6.9 Hz,1H,H-10),3.67 (s,3H,CH3O),3.43 (m,1H,H-9),2.30 (m,2H,H-2),2.05 (m,2H,H-13),1.72-1.17 (m,20H),0.88 (t,J= 6.9 Hz,3H,H-18)。

13C NMR (CDCl3,75 MHz)δ：174.2 (C-1),135.0 (C-11),129.3 (C-12),76.3 (C-10),74.8 (C-9),51.3 (CH3O),34.1 (C-2),33.0,32.3,31.4,29.6,29.3,29.2,29.0,28.8,25.6,25.0 (C-16,15,14,13,8,7,6,5,4,3),22.5 (C-17),13.0 (C-18)。

化合物(4)：產(chǎn)率>98%,solid,θmp36-38 ℃。

1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ：5.75 (dt,J= 15.6,6.4 Hz,1H,H-13),5.44 (ddt,J= 15.6,7.2,1 Hz,1 H,H-12),3.85 (t,J= 6.6 Hz,1H,H-11),3.67 (s,3H,CH3O),3.42 (m,1H,H-10),2.30 (t,2H,H-2),2.05 (m,2H,H-14),1.71-1.14 (m,20H,),0.89 (t,J= 6.9 Hz,3H,H-18)。

13C NMR (CDCl3,75 MHz)δ：174.2 (C-1),134.9 (C-12),129.4 (C-13),76.0 (C-11),74.8 (C-10),51.3 (CH3O),34.1 (C-2),33.0,32.3,31.7,29.2,29.1,29.0,28.9,28.8,25.5,24.9 (C-16,15,14,9,8,7,6,5,4,3),22.5 (C-17),14.0 (C-18)。

由數(shù)據(jù)分析，不飽和雙鍵上的兩個氫原子的偶合常數(shù)為J=15.6 Hz，推測不飽和雙鍵為反式(E)構(gòu)型。接羥基的兩個氫原子的偶合常數(shù)為J=6.9 Hz，推測為赤式(erythro)構(gòu)型，并且按照1,3-共軛雙鍵與SeO2的反應(yīng)機理也可以推測產(chǎn)物都為赤式構(gòu)型[5]。

3 結(jié) 論

SeO2是一種溫和的氧化劑，用SeO2進行烯丙位加氧是一個經(jīng)典的方法。本文將SeO2擴展用于羥基脂肪酸的合成上，SeO2與共軛亞油酸甲酯反應(yīng)生成了4個新的雙羥基衍生物。通過分析推測SeO2與共軛亞油酸甲酯的反應(yīng)是經(jīng)一條新的[4+2]反應(yīng)機理，即1,3-共軛雙烯在一定的反應(yīng)條件下與SeO2形成Se的環(huán)狀復(fù)合物，再進一步轉(zhuǎn)化為1,2-雙羥基化合物，這與我們傳統(tǒng)認為1,3-共軛雙烯與SeO2反應(yīng)生成1,4-雙羥基化合物的結(jié)論完全不同，這就為今后SeO2進行烯丙位加氧反應(yīng)的機理和產(chǎn)物的推測提供了重要的學(xué)術(shù)參考價值。

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