高齡老年人外周血樹突狀細(xì)胞亞群及表面標(biāo)志的分析

張興虎,萬文輝,齊玉琴,黃 方,范振芳,錢曉明

0 引 言

DC是已知體內(nèi)功能最強的抗原提呈細(xì)胞,也是唯一能在體內(nèi)直接激活初始(na?ve)T細(xì)胞,促進(jìn) T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的生成,并能促進(jìn) B細(xì)胞生成抗體的免疫細(xì)胞,DC處于啟動、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。在對抗原的攝取、加工、處理及呈遞過程中,DC具有一般的共性,同時也表達(dá)出一些特有的生物學(xué)特性。增齡引起的 DC功能下降減弱了機體免疫防御及免疫監(jiān)視作用,致使老年人容易患感染、腫瘤和自身免疫性疾病[1]。國外已有人對普通老年個體單核細(xì)胞誘生的 DC(MoDC)細(xì)胞表面標(biāo)志和免疫學(xué)功能做了一定研究[2],但對高齡老年個體外周血 MoDC未見有相應(yīng)的報道。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),檢測高齡老年人 MoDC細(xì)胞亞群和細(xì)胞表面標(biāo)志的變化,探討其在免疫衰老中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備 免疫熒光標(biāo)記的三色人 DC檢測試劑盒(3-color dendritic value bundle)購自美國Becton Dickinson公司,包括 FITC標(biāo)記的 Lineage Cocktail 1(lin1,由 抗 CD3、 CD14、 CD16、 CD19、CD20、CD56單抗混合組成)、PE標(biāo)記的抗 CD11c、PE標(biāo)記的抗 CD123(抗 IL-3Rα)及 PC5標(biāo)記的抗HLA-DR。流式細(xì)胞儀為BECKMAN COULTER公司的CYTOMICSFC500,分析軟件 CXPAnalysis。HLA-DRFITC、CD1a-FITC、 CD40-FITC、 CD80-PE、 CD86-PE、CCR-7-FE、CD209-PE、同亞型對照抗體均購自BD-PharMingen公司;樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基 CellGro-DC購自 CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4購自上海飛捷公司;淋巴細(xì)胞分離液購自 TBD公司;MTT購自上海生工公司;OptiLyse C溶血劑購自 BECKMAN COULTER公司,倒置顯微鏡(Zeiss Axiovert 40)。

1.2 臨床資料 觀察組為高齡老年人 30例(≥80歲 ),平均(85.6 ±4.5)歲,其中男 21例,女 9例 ,排除有腫瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑,并未接受免疫增強劑的治療;普通老年人 30例作為對照組,年齡 60～70歲,平均(64.8±5.1)歲,其中男 18例,女 12例,條件同觀察組。

1.3 DC亞群測定

1.3.1 免疫熒光標(biāo)記 嚴(yán)格按照說明書操作規(guī)程,每個樣本檢測分別取 2管,各加 100μl全血,一管中加入 lin1-FITC、CD123-PE、HLA-DR-PC5,另一管中加入 lin 1-FITC、CD11c-PE、HLA-DR-PC5,閉光 ,室溫孵育 15 min,然后每管加入 OptiLyse C溶血劑1m l,放置 5min,用含 1%的牛血清蛋白和 0.1%疊氮鈉的 PBS洗滌 2遍重新懸浮,進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測和分析 通過前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)設(shè)門去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片排除干擾,每個標(biāo)本計數(shù) 50000個細(xì)胞,用CXP軟件獲取及分析 HLA-DR/lin1點圖中的 HLADR陽性、lin 1弱陽性和陰性的細(xì)胞群體,以 CD11c和 CD123熒光抗體染色陽性細(xì)胞百分率記錄結(jié)果。

1.4 DC體外培養(yǎng) 新鮮采集的高齡老年人和普通老年人抗凝外周全各 20m l,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心(20℃,400×g,20 min),取界面細(xì)胞。置入50ml離心管中,用無鈣鎂 PBS(pH7.2)懸浮細(xì)胞,離心(650×g,10min)洗細(xì)胞 1次,離心(200×g,10 min)洗細(xì)胞 2次,洗盡血小板,用 CellGro-DC培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,加入 24孔板,每孔 2.5×106細(xì)胞 /ml培養(yǎng)基,37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng) 2h后,吸棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基輕輕洗培養(yǎng)板去除非貼壁細(xì)胞,即獲得貼壁的單核細(xì)胞,每孔加 1ml CellGro-DC培養(yǎng)基,rhGM-CSF 100 ng/ml,rhIL-4 500 U/ml,于培養(yǎng)第 7天收集懸浮細(xì)胞,即為 DC。

1.5 DC表面標(biāo)志測定 收集培養(yǎng)第 7天的懸浮細(xì)胞,用 PBS懸浮為 1×106細(xì)胞 /ml,100μl/管加入流式標(biāo)記管,分別加入各標(biāo)記抗體及對照抗體,終濃度5μg/ml,置暗處,4℃標(biāo)記 30 min,加入 4 ml PBS,200×g離心 10min,去掉上清液,如此洗滌共 2次。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面 CD1a、人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)-DR、CD80、CD86、CD40、趨化因子受體-7(chemokine receptor-7,CCR-7)和 CD209,設(shè)立 FSC/SSC,FL1/FL2分析窗口,在FSC/SSC將主細(xì)胞群體設(shè)門,在 FL1/FL2窗口分析陽性細(xì)胞比例,用直方圖顯示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計量資料用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,2組均數(shù)比較用秩和檢驗,以 P≤0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 DC亞群 外周血經(jīng)抗體標(biāo)記后,流式細(xì)胞儀分析 HLA-DR/lin1點圖中的 HLA-DR陽性、lin 1弱陽性和陰性的細(xì)胞群體(B門),CD11c熒光抗體染色陽性細(xì)胞為 DC1細(xì)胞的百分率,CD123熒光抗體染色陽性細(xì)胞為 DC2細(xì)胞的百分率(圖1)。

實驗結(jié)果顯示高齡老年人組 DC1占白細(xì)胞總數(shù)的百分比較普通老年人組明顯低(P＜0.05),DC1與 DC2的比值與后組也有明顯差異(P＜0.05)(表1),而 DC2占白細(xì)胞總數(shù)的百分比較普通老年人組無明顯變化(P＞0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測 DC 1和 DC 2Figure 1 Detection of DC 1 and DC 2by flow cytometry

2.2 DC表面免疫表型分析 收集培養(yǎng)第 7天的懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測表明,高齡老年人組外周血培養(yǎng)獲得的細(xì)胞表達(dá) DC標(biāo)志 CD1a的細(xì)胞陽性率低,為 5%～38%,而普通老年人組 CD1a細(xì)胞陽性率為 33%～92%。高齡老年人組 DC表達(dá) CD40、CD80、CD86、CD209分子的水平均低于普通老年人組,而 2組間 HLA-DR、CCR-7表達(dá)無明顯差異(表2,圖2)。

表1 2組老年人DC亞群均值及比值的比較(s)Table 1 Com parison of the m ean value and ratios of DCs between the aged and elderly groups(s)

表1 2組老年人DC亞群均值及比值的比較(s)Table 1 Com parison of the m ean value and ratios of DCs between the aged and elderly groups(s)

與普通老年人組相比較,*P＜0.05

組 別 n DC1/CD11c DC2/CD 123 DC1/DC2高齡老年人組 30 0.207±0.061*0.172±0.045 1.523±0.386*普通老年人組 30 0.298±0.051 0.149±0.031 2.859±0.895

圖2 體外培養(yǎng)第 7天時生成DC的免疫表型Figure 2 Imm unophenotypes of DCs at the 7th day of in vitro cu lture

表2 2組 DC表面標(biāo)志物陽性細(xì)胞的表達(dá)(%)Table 2 Exp ressions of DC surfacem arkers in the aged and elderly between tw o groups(%)

3 討 論

免疫衰老是目前老年醫(yī)學(xué)研究的熱點之一,有研究表明 T細(xì)胞和 B細(xì)胞絕對數(shù)隨著機體老化呈下降趨勢,其表現(xiàn)是多樣的,DC在攝取抗原或受到某些刺激因子刺激后,可以分化成熟,成熟的 DC迅速失去吞噬活性,并增加主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)分子與肽復(fù)合物的表達(dá)和穩(wěn)定性,上調(diào)輔助刺激因子和黏附分子的表達(dá),分泌趨化因子等細(xì)胞因子,DC的這一功能有效地將抗原遞呈給初始 T細(xì)胞并使之激活。而機體衰老過程中 DC的分化和功能的改變已起了人們的關(guān)注,然而有關(guān)此方面的研究卻少有報道[3-4]。

DC不管在其來源、表型還是在功能上都是異質(zhì)性群體,機體內(nèi)存在不同的 DC亞群,主要分為 2個DC亞群:DC1亞群為髓樣細(xì)胞來源(myeloid DC),它以 CD11c+DC前體形式存在于外周血中,在炎癥刺激時分化為成熟的 CD11c+DC,產(chǎn)生 IL-12,促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為 Th1細(xì)胞,介導(dǎo)細(xì)胞免疫;DC2亞群為淋巴樣細(xì)胞來源(lymphoid DC),由其 CD123+DC前體細(xì)胞加 IL-3誘導(dǎo)后分化為成熟的淋巴樣DC,誘導(dǎo) Th2應(yīng)答,介導(dǎo)體液免疫[5-6]。本研究結(jié)果顯示高齡老年人組 DC1占白細(xì)胞總數(shù)的百分比較普通老年人組明顯低(P＜0.05),DC2占白細(xì)胞總數(shù)的百分比較普通老年人組無明顯變化(P＞0.05),DC1與 DC2的比值也較后組明顯低(P＜0.05),高齡老年人的細(xì)胞免疫功能明顯下降的,TH1和 TH2細(xì)胞功能平衡失調(diào),這與高齡老年人許多免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生直接相關(guān)。

DC表面標(biāo)志 CD1a、HLA-DR、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CCR-7和 CD209參與了免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)。CD1a是鑒定DC的最好標(biāo)志,DC可以應(yīng)用CD1a來提呈脂類抗原。 CD80、CD86、CD40是 DC表面的協(xié)同刺激分子,它們能使 DC有效攝取及加工提呈抗原,同時提供 T細(xì)胞活化所需的共刺激信號,從而啟動T細(xì)胞應(yīng)答[7],CD40可促進(jìn) B細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖和成熟,促進(jìn) T細(xì)胞的定向分化。HLA-DR為MHC-Ⅱ類分子,是成熟 DC抗原表面高表達(dá)的一類重要分子,主要參與識別和遞呈外源性抗原。DC成熟過程中其細(xì)胞膜上 CCR7表達(dá)上調(diào),在趨化 DC從外周組織遷移到次級淋巴器官中起關(guān)鍵作用[8],并可調(diào)控 DC的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、遷移速度和成熟等。成熟和未成熟的 DC均高表達(dá)模式識別受體 CD209(DC-SIGN),識別并幫助 DC捕獲吞噬抗原。高齡老年人組外周血培養(yǎng)獲得的細(xì)胞表達(dá) DC標(biāo)志 CD1a的細(xì)胞陽性率明顯較普通老年人組低。高齡老年人組 DC表達(dá) CD40、CD80、CD86、CD209分子的水平均低于普通老年人組,而 2組間 HLA-DR、CCR-7表達(dá)無明顯差異。從本研究結(jié)果看,高齡老年人 DC的亞群和表面標(biāo)志較普通老年人出現(xiàn)了一定程度的減退,這似乎可以解釋臨床高齡老人較普通老人更易患感染性疾病和腫瘤,并且DC的上述改變也可能與其他多種老年性疾病的發(fā)生有關(guān)。

當(dāng)今世界人口老齡化是一個發(fā)展趨勢,并且高齡老年人群在老年人群中所占的比例越來越大,高齡老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的發(fā)病率明顯增加,已嚴(yán)重影響了他們的生命質(zhì)量,如何減少感染性疾病的發(fā)生率,提高他們的生活質(zhì)量成為當(dāng)今老年病學(xué)的一個重要的研究課題。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究高齡老年免疫衰老的發(fā)病機制及有效干預(yù)提供了一個可靠的實驗理論依據(jù)。

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