高效液相色譜法測定還原固精丸中馬錢苷的含量

胡 敏，金 鳴，陳三理

(福建省藥品檢驗(yàn)所，福建 福州 350001)

還原固精丸由山茱萸，黃柏，知母，牡丹皮等十四味藥材經(jīng)一定工藝加工制成，具有滋陰，補(bǔ)腎，澀精之功效。方中山茱萸具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫等作用［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山茱萸中有效成分馬錢苷測定的方法有高效液相色譜法［2-3］，膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法［4］。本文采用高效液相色譜法，對(duì)還原固精丸中山茱萸所含馬錢苷進(jìn)行含量測定，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1 儀器和試藥

島津LC-2010AHT高效液相色譜系統(tǒng)(自動(dòng)進(jìn)樣器﹑二級(jí)管陣列檢測器﹑Solution色譜工作站);Nicolet Evolution紫外檢測儀。

馬錢苷對(duì)照品(批號(hào):11640-200502，中國藥品生物制品檢定所);還原固精丸及還原固精丸缺山茱萸陰性樣品(泉州中僑(集團(tuán))股份有限公司藥業(yè)公司提供);四氫呋喃、甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水;磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Welch Materials XB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液(1∶6∶4∶89);檢測波長:236 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取馬錢苷對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每1 mL含馬錢苷30 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率 40 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

取缺山茱萸的陰性樣品適量，按供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件，對(duì)還原固精丸以及缺山茱萸陰性樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果陰性樣品在與馬錢苷對(duì)照品保留時(shí)間(約20.7 min)相應(yīng)處無色譜峰出現(xiàn)(見圖1)，表明方中其他藥味對(duì)供試品中馬錢苷的測定無干擾。

圖1 對(duì)照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C)高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of reference substance(A)，sample(B)and blank(C)

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取馬錢苷對(duì)照品11.13 mg，至25 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.405 2 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.5，1，2，5 mL 至10 mL 量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的對(duì)照品溶液。吸取上述各濃度溶液10 μL注入液相色譜儀中，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為:Y=164 482 6 X+5 664，r=1.000 0，表明馬錢苷在0.040 52 ～4.052 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào):050501)，照上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄馬錢苷峰面積，結(jié)果RSD=0.55%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批還原固經(jīng)丸樣品(批號(hào):050501)，按2.3方法制備6份供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果馬錢苷平均含量為0.773 mg/g，RSD=0.56%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào):050501)，分別于供試品溶液制備完成后的0，4，8，12 h進(jìn)樣，測定馬錢苷的峰面積。結(jié)果RSD=0.52%，表明供試品溶液中的馬錢苷放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn)

取已知馬錢苷含量的同一批供試品(批號(hào):050501)適量，研細(xì)，各精密稱取約0.5 g，平行9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入0.401 6 mg/mL馬錢苷對(duì)照品溶液 0.8，1.0，1.2 mL 各 3 份，揮干溶劑，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測定馬錢苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表 1，平均回收率為101.04%，RSD(n=9)為 1.60%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.1 The result of recoveries(n=9)

2.11 樣品測定

取還原固精丸樣品3批，照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of sample(n=3)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

有關(guān)山茱萸含量測定方法的研究頗多，主要是以熊果酸、齊墩果酸和馬錢苷等為含量檢測指標(biāo)。山茱萸中熊果酸含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道雖比較多，但熊果酸存在于許多藥材如山楂，馬鞭草，車前草、紫珠，女貞子，懷牛膝等，非山茱萸的特有成分。馬錢苷為山茱萸主要有效成分，測定其含量，可為山茱萸及其制劑提供質(zhì)量控制的有效手段。

3.2 提取溶劑的選擇

取樣品1 g，3份，精密稱定，分別精密加入甲醇、80%甲醇、50%甲醇25 mL，超聲30 min，測定馬錢苷含量。結(jié)果表明采用80%甲醇為溶劑提取最完全，故選用80%甲醇為供試品的提取溶劑。

3.3 提取時(shí)間的選擇

取樣品1 g，3份，精密稱定，精密加入80%甲醇25 mL，超聲時(shí)間分別為 20，30，40 min，其他條件相同，測定馬錢苷含量。結(jié)果表明超聲20 min時(shí)，供試品中的馬錢苷能提取完全，故采用超聲20 min。

3.4 流動(dòng)相的選擇

曾采用甲醇-水、乙腈-水、四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行色譜分析。結(jié)果以四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05% 磷酸溶液(1∶6∶4∶89)作為流動(dòng)相能夠?qū)ⅠR錢苷峰與雜質(zhì)峰較好的分離，且峰形理想。

［1］劉 洪，許惠琴.山茱萸及其主要成分的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(4):254.

［2］唐益華，肖凱華.RP-HPLC法測定濃縮六味地黃丸中馬錢苷的含量［J］.中國藥事，2007，21(10):834-835.

［3］張先瑞.HPLC法測定耳聾左慈丸中馬錢苷的含量［J］.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2007，13(16):113-115.

［4］趙新峰，孫 毓.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定山茱萸中莫羅苷和番木鱉苷的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(8):1154-1157.