參附注射液對(duì)失血性休克家兔腸系膜上靜脈缺血再灌注小腸黏膜損傷的保護(hù)作用

方 軍，陶禮鈞，吳作株，陳必成

(溫州醫(yī)學(xué)院 1.附屬第一醫(yī)院，2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 325000)

隨著交通事故增多，臨床上腸系膜撕裂傷致腸系膜上靜脈破裂合并失血性休克病例日漸增多，手術(shù)中需阻斷腸系膜上靜脈進(jìn)行修補(bǔ)，因此小腸黏膜需承受失血性休克低灌注、靜脈阻斷無(wú)血流及開(kāi)放后缺血再灌注三重?fù)p傷，可引起一系列腸道反應(yīng)，激活腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β 等細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放，并激活炎癥細(xì)胞和毒性介質(zhì)，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加、屏障破壞、并發(fā)生細(xì)菌易位［1］。易位的細(xì)菌產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素并釋放至血液，形成內(nèi)毒素血癥，并激活機(jī)體免疫炎癥防御機(jī)制，導(dǎo)致自身中毒和組織損害;不僅如此，細(xì)菌和內(nèi)毒素易位還導(dǎo)致胃腸黏膜局部免疫炎癥系統(tǒng)的激活，細(xì)胞因子和其它免疫炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，這些腸源性介質(zhì)進(jìn)一步加劇全身炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致腸通透性進(jìn)一步升高，從而形成通透性升高－毒性介質(zhì)的釋放－通透性進(jìn)一步升高的惡性循環(huán)，加劇全身炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體各器官繼發(fā)性損害，甚至多器官功能衰竭［2-3］。

本實(shí)驗(yàn)采用失血性休克動(dòng)物模型模擬臨床腸系膜上靜脈破裂致失血性休克病例，觀察失血性休克、靜脈阻斷及開(kāi)放后缺血再灌注多重?fù)p傷對(duì)小腸黏膜結(jié)構(gòu)和屏障功能的影響，并觀察參附注射液對(duì)小腸黏膜的保護(hù)作用。

1 材料

參附注射液(10 mL/支，批號(hào):080116)，雅安三九藥業(yè)有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào):20080321)，南京建成生物工程研究所;鱟試劑(批號(hào):080124)，廈門鱟試劑廠。

日本大白兔，體重 1.5 ～2.5 kg，雌雄不限，由余姚市泗門鎮(zhèn)建飛實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證號(hào):SCXK(浙)2006-0026。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立與分組

日本大白兔30只，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，插管接多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓;分離右側(cè)頸外靜脈用于輸液及給藥，穩(wěn)定10 min。隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組和參附注射液組。正常對(duì)照組:直接開(kāi)腹取小腸標(biāo)本，分離腸系膜上靜脈取血液標(biāo)本;模型對(duì)照組:經(jīng)左頸總動(dòng)脈放血使平均動(dòng)脈壓在10 min內(nèi)降至50 mmHg，建立休克模型，并通過(guò)動(dòng)脈放血和靜脈回輸，維持平均動(dòng)脈壓在50 mmHg水平，休克1 h后開(kāi)腹，在開(kāi)腹前30 min經(jīng)右頸外靜脈輸注2.5 mL/kg生理鹽水，開(kāi)腹后分離出腸系膜上靜脈，取休克1 h后腸系膜上靜脈血樣，并阻斷腸系膜上靜脈，同時(shí)開(kāi)始回輸自體血及等量生理鹽水，糾正休克，5 min后開(kāi)放阻斷，1 h后取再灌注1 h腸系膜上靜脈血樣，取小腸樣本;參附注射液組:除用2.5 mL/kg參附注射液代替生理鹽水外，其余操作同模型對(duì)照組。

2.2 樣品采集和測(cè)定

2.2.1 小腸病理學(xué)檢查 距回盲部2 cm以上取回腸5 cm，常規(guī)固定、石蠟包埋、切片(3 ～4 μm)，HE染色。采用奧林巴斯BX41圖像采集分析系統(tǒng)，觀察3張非連續(xù)性切片，每張切片在圖象分析儀上測(cè)定10個(gè)絨毛腸黏膜厚度、腸絨毛高度。取平均值。

2.2.2 MDA測(cè)定 模型對(duì)照組和參附注射液組分別于休克1 h后、再灌注1 h后取腸系膜上靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取血清低溫保存。正常對(duì)照組于建立頸部插管10 min后即開(kāi)腹取血。按試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA含量。

2.2.3 血漿內(nèi)毒素測(cè)定 模型對(duì)照組和參附注射液組分別于休克1 h后、再灌注1 h后取腸系膜上靜脈血1 mL加抗凝劑1 mL，1 000 r/min離心10 min，取血漿，－18℃保存。正常對(duì)照組于建立頸部插管10 min后即開(kāi)腹取血。采用偶氮鱟試劑基質(zhì)顯色法，按試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定內(nèi)毒素。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用(x±s)表示。兩組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用兩樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小腸黏膜厚度和絨毛高度

結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。正常對(duì)照組絨毛排練有序，黏膜完整，無(wú)絨毛脫落壞死，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組小腸黏膜厚度及絨毛高度明顯下降(P＜0.01)，絨毛間距變寬，部分上皮細(xì)胞壞死脫落，部分頂端絨毛脫落。參附注射液組小腸黏膜厚度及絨毛高度較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)，但較模型對(duì)照組有明顯改善(P＜0.01)。

圖1 正常對(duì)照組(A)、模型對(duì)照組(B)和參附注射液組(C)小腸病理切片(HE染色，×400)Fig.1 Slice of ileum of normal control group(A)，model control group(B)，and Shenfu Injection group(C)(HE staining，×400)

3.2 MDA及內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。模型對(duì)照組和參附注射液組休克1 h后血漿MDA及內(nèi)毒素水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，經(jīng)腸系膜上靜脈阻斷、再灌注1 h等損傷后兩組血漿MDA及內(nèi)毒素水平較休克1 h時(shí)再次明顯升高(P＜0.01);相同時(shí)間點(diǎn)血漿MDA及內(nèi)毒素水平參附注射液組較模型對(duì)照組顯著下降(P ＜0.01 或0.05)。

表1 參附注射液對(duì)休克及腸系膜上靜脈缺血再灌注家兔的小腸黏膜厚度和絨毛高度的影響(± s，n=10)Tab.1 Effects of Shenfu Injection on the ileum mucosa thickness and villus height endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

表1 參附注射液對(duì)休克及腸系膜上靜脈缺血再灌注家兔的小腸黏膜厚度和絨毛高度的影響(± s，n=10)Tab.1 Effects of Shenfu Injection on the ileum mucosa thickness and villus height endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

與正常對(duì)照組比較:1P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:2P＜0.01Compared with normal control:1P ＜0.01;Compared with model control:2P ＜0.01

組 別 黏膜厚度/μm 絨毛高度/μm正常對(duì)照組513.3 ±18.5 403.4 ±12.9模型對(duì)照組 432.9 ±27.51 298.2 ±17.71參附注射液組 469.5 ±12.81，2 365.3 ±10.91，2

4 討論

參附注射液是紅參與附子的提取物，其有效成分是人參皂苷和烏頭類生物堿，參附注射液因其“多靶效應(yīng)”廣泛應(yīng)用于臨床抗休克、心律失常、心力衰竭甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)的救治;體外研究表明，它還能抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞株的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。其可能的機(jī)制有:①延長(zhǎng)耐受缺氧的時(shí)間，增加血供及氧合，改善再灌注組織微循環(huán)并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)2，3-二磷酸甘油酸水平，促進(jìn)氧的釋放與應(yīng)用;②保護(hù)超氧化物岐化酶(SOD)活性抗脂質(zhì)過(guò)氧化和滅活黃嘌呤氧化酶;③阻滯Ca2+通道，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+;④促進(jìn)前列環(huán)素釋放，抑制 TXA2合成，減弱炎性介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［5］。參附注射液注射后可有效改善組織的微循環(huán)狀態(tài)，使能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給增加，從而使組織細(xì)胞的功能得到改善。

表2 參附注射液對(duì)休克及腸系膜上靜脈缺血再灌注家兔血漿MAD及內(nèi)毒素水平的影響(± s，n=10)Tab.2 Effects of Shenfu Injection on the plasma MDA and endotoxin levels endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

表2 參附注射液對(duì)休克及腸系膜上靜脈缺血再灌注家兔血漿MAD及內(nèi)毒素水平的影響(± s，n=10)Tab.2 Effects of Shenfu Injection on the plasma MDA and endotoxin levels endured haemorrhagic shock and superior mesenteric vein blocking(± s，n=10)

與正常對(duì)照組比較:1P＜0.01;與模型對(duì)照組比較:2P＜0.01，3P＜0.05;與休克1 h時(shí)比較:4P＜0.01Compared with normal control:1P ＜0.01;Compared with model control:2P ＜0.01，3P ＜0.05;Compared with shock 1 h:4P ＜0.01

組 別 MDA/(nmol/L)休克1 h時(shí) 再灌注1 h時(shí)內(nèi)毒素/(EU/mL)休克1 h時(shí) 再灌注1 h時(shí)正常對(duì)照組8.46 ±0.51 0.278 ±0.062模型對(duì)照組 14.40 ±0.801 20.07 ±0.911，4 0.440 ±0.0641 0.778 ±0.0841，4參附注射液組 11.06 ±0.871，2 16.10 ±0.791，2，4 0.350 ±0.0481，2 0.664 ±0.1031，3，4

本研究結(jié)果表明，在開(kāi)腹前30 min給予參附注射液后，休克1 h后及再灌注1 h后血漿內(nèi)毒素及MDA水平均較模型對(duì)照組明顯下降，證實(shí)參附注射液在失血性休克及缺血-再灌注多個(gè)環(huán)節(jié)起到保護(hù)小腸黏膜結(jié)構(gòu)和屏障功能的作用，推測(cè)和其改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫功能，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗缺血、缺氧，清除氧自由基，抗脂質(zhì)氧化反應(yīng)等作用有關(guān)。

在缺血再灌注導(dǎo)致腸黏膜和屏障損傷的過(guò)程中，TNF-α起著十分重要的作用。TNF-α可激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)眾多的黏附分子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在組織中的聚集，局部炎癥反應(yīng)加重，腸黏膜細(xì)胞壞死凋亡，黏膜屏障破壞，而參附注射液預(yù)處理能明顯抑制血漿和腸組織中TNF-α水平的升高，從而阻斷了由于早期TNF-α合成與釋放增加而介導(dǎo)的一系列生物效應(yīng)［6］。在缺血再灌注時(shí)腸道黏膜細(xì)胞凋亡數(shù)量大量增多，參附注射液能降低缺血再灌注腸細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)caspase-3表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，從而抑制腸黏膜缺血再灌注時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞的異常凋亡，減輕腸黏膜缺血再灌注損傷［7］。這也可能是參附注射對(duì)腸道黏膜保護(hù)的另一種途徑。

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