SB203580對(duì)受輻射小鼠免疫細(xì)胞的影響

李德冠，王月英，王小春，王 彥，路 璐，吳紅英，張 恒，張俊伶，常建輝，翟志斌，孟愛民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

免疫系統(tǒng)對(duì)輻射極為敏感，故免疫系統(tǒng)損傷在放射疾病、輻射事故以及臨床放化療時(shí)會(huì)受到不同程度的損傷，機(jī)體免疫功能下降，造成免疫力低下，引起繼發(fā)感染等。研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在輻射引起的細(xì)胞損傷過程中起一定的作用，抑制該通路可緩解細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)引起的造血干細(xì)胞衰竭［1-3］。

SB203580是廣泛應(yīng)用的p38 MAPK通路抑制劑，能降低細(xì)胞中p38表達(dá)水平，有效抑制p38 MAPK通路［4-5］。本實(shí)驗(yàn)中我們給予受照射小鼠腹腔注射p38抑制劑SB203580，觀察抑制p38通路對(duì)輻射免疫損傷的影響，探討其作為輻射防護(hù)藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

SB203580(美國 LB laboratory);RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Gibco公司);倒置顯微鏡(日本Olympus);流式細(xì)胞儀Coulter Altra(美國Beckman);全自動(dòng)血液分析儀poch-100i(日本sysmex);infinite200多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan);137Cs γ射線照射源USD，Autocell 40(加拿大原子能有限公司)，劑量率0.80 Gy/min。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6純系小鼠，雄性，體重20～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(京)2008-0003。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及給藥 將C57BL/6小鼠30只，分為對(duì)照組、照射組和SB組，每組10只。對(duì)照組接受假照射，其余2組進(jìn)行2Gy劑量的γ射線照射。SB組于照射后24 h開始給藥，給藥劑量為15 mg/kg，腹腔給藥，隔日1次，共5次，對(duì)照組、照射對(duì)照組于相同時(shí)間皮下注入等量二甲亞砜(DMSO);末次給藥24 h后處死小鼠，取外周血進(jìn)行分型 CD4、CD8、B220檢測，取骨髓細(xì)胞測定ROS。

1.3.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 外周血取后用K3EDTA抗凝，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測。采用傳統(tǒng)的顯微鏡分類法，取血、涂片、自然晾干，經(jīng)瑞氏染色，水漂洗晾干后，每張血涂片于顯微鏡(油鏡)觀察100個(gè)白細(xì)胞，按白細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征逐個(gè)分別計(jì)數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占的百分比。

1.3.3 外周血細(xì)胞分型測定 取抗凝血50 μL加入到紅細(xì)胞裂解液1 mL中，劇烈震蕩混勻，避光放置15 min。隨后加入含1%血清的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)1 mL，1 000 r/min 離心 5 min。洗滌兩次后棄上清，用PBS 100 μL懸起細(xì)胞，再加相應(yīng)抗體混勻，避光孵育15 min。最后加入PBS或者鞘液400 μL，混勻過200目濾網(wǎng)濾入流式管，上機(jī)檢測。并用EXPO32軟件進(jìn)行檢測與用配套的EXPO32 Analysis軟件進(jìn)行分析。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測 無菌條件下取小鼠的單側(cè)股骨，用PBS沖洗進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，裝入EP管中裝載探針，37℃孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至黑色96孔板中，多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)

在第10天，取血樣進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。當(dāng)小鼠受照射后，白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SB組白細(xì)胞數(shù)，比對(duì)照組也顯著下降(P＜0.05)，與照射組相比無顯著變化。但SB組淋巴細(xì)胞比例，卻顯著高于照射組(P＜0.05)，與對(duì)照組相近，表明SB對(duì)淋巴細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

2.2 外周血淋巴細(xì)胞分型

在第10天，取血樣破紅后進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。與對(duì)照組比較，小鼠受照射后，CD4細(xì)胞比例增加、B220細(xì)胞比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，SB組CD4與B220細(xì)胞變化趨勢與照射組一致，但其CD8比例卻升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 SB對(duì)受照小鼠白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例的影響(± s，n=10)Tab.1 The effects of SB on the white cells and lymphocyte rate in the peripheral blood(± s，n=10)

表1 SB對(duì)受照小鼠白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例的影響(± s，n=10)Tab.1 The effects of SB on the white cells and lymphocyte rate in the peripheral blood(± s，n=10)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與照射組比較:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

組 別 白細(xì)胞數(shù)/(109/L) 淋巴細(xì)胞比例/% 中性粒細(xì)胞比例/%對(duì)照組5.4 ±1.0 87.8 ±1.7 12.2 ±1.7照射組 2.0 ±0.61 71.4 ±5.81 28.6 ±5.81 SB 組 1.6 ±0.41 86.0 ±2.72 14.0 ±2.72

表2 小鼠淋巴細(xì)胞分型(± s，n=10)Tab.2 The lymphocyte phenotypes in different mice groups(± s，n=10)

表2 小鼠淋巴細(xì)胞分型(± s，n=10)Tab.2 The lymphocyte phenotypes in different mice groups(± s，n=10)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與照射組比較:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

組 別CD4/% CD8/% B220/%對(duì)照組19.7 ±2.5 14.3 ±2.2 53.0 ±13.0照射組 26.9 ±6.11 12.0 ±0.9 24.7 ±2.01 SB 組 27.2 ±4.31 17.4 ±2.21，2 19.6 ±6.91

2.3 ROS的檢測

在第10天，收集小鼠骨髓細(xì)胞，按照ROS檢測試劑盒說明操作，檢測結(jié)果如表3所示。與對(duì)照組相比，照射組與SB組小鼠的骨髓細(xì)胞ROS水平均明顯升高(P＜0.05);而SB組的ROS水平明顯低于照射組(P ＜0.05)。

表3 各組骨髓細(xì)胞ROS水平檢測結(jié)果(± s，n=10)Tab.3 The detection of ROS level in bone marrow cells(± s，n=10)

表3 各組骨髓細(xì)胞ROS水平檢測結(jié)果(± s，n=10)Tab.3 The detection of ROS level in bone marrow cells(± s，n=10)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與照射組比較:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

組 別 ROS水平(熒光值)ROS/%對(duì)照組4 118±23 100±0.5照射組 4 942±1071 120±2.21 SB 組 4 530 ± 311，2 110 ± 3.91，2

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，普遍存在于多種生物，包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是當(dāng)前細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的熱點(diǎn)。近年來p38 MAPK通路在造血免疫系統(tǒng)中的作用研究已逐步展開，已證實(shí)抑制p38通路激活會(huì)保護(hù)造血祖細(xì)胞功能［6］。

機(jī)體受到輻射后，骨髓細(xì)胞的增殖、分裂功能受到損傷，導(dǎo)致血細(xì)胞來源減少，從而引起外周血象不同程度的變化。但各類細(xì)胞壽命不同，輻射敏感性不同，其中淋巴細(xì)胞變化最為明顯［7］。白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)是血常規(guī)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，對(duì)臨床診斷及治療起到一定的作用。我們通過測定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化，觀察了輻射及SB203580對(duì)小鼠免疫功能的影響。研究結(jié)果顯示在2Gy照射后，外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組相比，均呈明顯減少趨勢。而SB203580對(duì)外周血白細(xì)胞總數(shù)未見保護(hù)作用，對(duì)淋巴細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

此外，我們還用流式細(xì)胞儀測定了外周血中T細(xì)胞，B細(xì)胞亞型所占比例。結(jié)果顯示在2Gy照射后，外周血中CD4陽性細(xì)胞比例比對(duì)照組有顯著增加，說明2Gy照射對(duì)CD4細(xì)胞有刺激作用。SB組對(duì)CD4與B220未見明顯影響。CD8陽性細(xì)胞在受照組小鼠中比例下降，表明輻射會(huì)降低小鼠的免疫保護(hù)作用［8］，而SB203580能顯著提高受照小鼠中CD8細(xì)胞比例，表明抑制p38通路可增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

電離輻射能誘發(fā)細(xì)胞ROS水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者衰老，ROS水平升高是小鼠輻射損傷的部分原因［9］。本實(shí)驗(yàn)檢測了骨髓細(xì)胞中ROS水平變化，發(fā)現(xiàn)2Gy照射后骨髓細(xì)胞ROS水平升高，而SB能夠有效降低骨髓細(xì)胞 ROS水平，表明SB203580可通過降低ROS從而對(duì)小鼠的輻射損傷給予保護(hù)。

綜上所述，電離輻射對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞均造成了損傷。而SB203580對(duì)輻射損傷小鼠的免疫細(xì)胞均具有一定的保護(hù)作用，尤其是能提高外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞比例，降低骨髓細(xì)胞ROS水平。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為p38抑制劑應(yīng)用于治療電離輻射損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Fliedner T M，Graessle D H.Hematopoietic cell renewal systems:mechanisms of coping and failing after chronic exposure to ionizing radiation［J］.Radiat Environ Biophys，2008，47(1):63-69.

［2］Dent P，Yacoub A，F(xiàn)isher P B，et al.MAPK pathways in radiation responses［J］.Oncogene，2003，22(37):5885-5896.

［3］Ito K，Hirao A，Arai F，et al.Reactiveoxygen species act through p38 MAPK to limit thelifespan of hematopoietic stem cells［J］.Nat Med，2006，12:446-451.

［4］Johnson G L，Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK，JNK，and p38 protein kinases［J］.Science，2002，298:1911-1912.

［5］Zarubin T，Han J.Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway［J］.Cell Res，2005，15(1):11-18.

［6］Navas T A，Mohindru M，Estes M，et al.Inhibition of overactivated p38 MAPK can restore hematopoiesis in myelodysplastic syndrome progenitors［J］.Blood，2006，108(13):4170-4177.

［7］陳加佩，毛秉智.輻射血液學(xué)－基礎(chǔ)與臨床［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社，2002:186-190.

［8］劉曉冬，金順子.輻射免疫學(xué)研究［M］.吉林:吉林大學(xué)出版社，2005:8-40.

［9］Jang Y，Sharkis S.A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem cells that may reside in the low-oxygenic niche［J］.Blood，2007，110(8):3056-3063.