人參皂苷Rb1抗抑郁作用的動物行為學(xué)研究

李玉倩，王 芳，陳建國

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系 湖北 武漢 430030;2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院 臨床藥學(xué)系河南鄭州 450001)

兩千多年來，人參在中國一直作為一種傳統(tǒng)的補藥，人參根也是在世界范圍內(nèi)使用最廣的中藥之一。作為人參根的重要活性成分之一，人參皂苷Rb1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮著很多藥理作用，如中樞興奮、改善學(xué)習(xí)記憶、抗疲勞、抗衰老等神經(jīng)保護作用和增強機體的抗應(yīng)激能力等［1］，但關(guān)于人參皂苷Rb1的抗抑郁作用，目前尚未見相關(guān)報導(dǎo)。本文分別以小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗，大鼠多次給藥強迫游泳實驗對該藥物的抗抑郁作用進行了初步篩選;然后通過連續(xù)21d不可預(yù)知性慢性刺激構(gòu)建大鼠中度慢性應(yīng)激模型(CMS)，觀察人參皂苷Rb1的抗抑郁作用，為人參皂苷Rb1今后用于臨床抑郁癥治療提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性昆明種小鼠，體重(20±2)g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供;雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，由湖北省實驗動物中心提供。實驗前1周購進，自由飲食，飼養(yǎng)室溫為(23±1)℃，光照周期為12 h/12 h(7:00/19:00)。

1.2 主要藥品及試劑 人參皂苷Rb1的純度大于98%，由吉林大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供;鹽酸丙咪嗪的純度大于99%，購自美國Sigma公司。各藥品臨用時均用0.9%的生理鹽水新鮮配制并稀釋到所需濃度。

1.3 研究方法

1.3.1 小鼠懸尾實驗:昆明種雄性小鼠60只，隨機平均分為5組:空白組(生理鹽水)，陽性對照組(丙咪嗪，30 mg/kg)，人參皂苷 Rb1低劑量組(1.25 mg/kg)，中劑量組(2.5 mg/kg)，高劑量組(5.0 mg/kg)。腹腔注射給藥，給藥體積為10 ml/kg。給藥30 min后將小鼠尾部距尾端1 cm處用膠布固定于支撐物，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部離下方臺面約50 cm，頭部周圍用板隔離，使其不能看到周圍事物。觀察時間為6 min，并累計記錄6 min內(nèi)的不動時間。房間內(nèi)保持安靜、光線柔和。為保證實驗數(shù)據(jù)的客觀性，實驗中均采用盲法進行測定。

1.3.2 小鼠強迫游泳實驗:昆明種雄性小鼠60只，分組及給藥情況同前。給藥前每只動物先入水訓(xùn)練15 min，24 h后給藥，給藥30 min后把小鼠放入高20 cm，水深10 cm，直徑14 cm，水溫(25±1)℃的玻璃容器中強迫游泳6 min，記錄后4 min內(nèi)累計不動時間。動物頭部露出水面，四肢不動或為使自己不下沉所做的細小動作均稱為不動。每只動物實驗完后均用毛巾擦干，放入溫暖的籠中。房間保持安靜、光線柔和，實驗過程中不動時間的記錄在DVR數(shù)字監(jiān)控系統(tǒng)下進行。實驗中采用盲法進行測定。

1.3.3 大鼠強迫游泳實驗:Wistar雄性大鼠50只，隨機平均分為5組:空白組(生理鹽水)，陽性對照組(丙咪嗪，30 mg/kg)，人參皂苷Rb1低劑量組(1.25 mg/kg)，中劑量組(2.5 mg/kg)，高劑量組(5.0 mg/kg)。腹腔注射給藥，給藥體積2 ml/kg。給藥前每只動物先入水訓(xùn)練15 min，24 h后開始給藥，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥30 min后大鼠放入高40 cm，水深24 cm，直徑18 cm，水溫(25±1)℃的玻璃容器中強迫游泳6 min，記錄動物后4 min內(nèi)的累計不動時間。實驗過程中不動潛伏期和不動時間的記錄在DVR數(shù)字監(jiān)控系統(tǒng)下進行。實驗中采用盲法進行測定。

1.3.4 慢性中度應(yīng)激模型:參照 Willner的方法［2］，建立21 d不可預(yù)知性慢性刺激應(yīng)激抑郁癥模型。Wistar雄性大鼠60只，隨機分為6組，每組10只:空白組(生理鹽水)，陽性對照組(丙咪嗪，15 mg/kg)，人參皂苷Rb1 低劑量組(1.25 mg/kg)，中劑量組(2.5 mg/kg)，高劑量組(5.0 mg/kg)。腹腔注射給藥，給藥體積為2 ml/kg。每日刺激前給藥1次，連續(xù)給藥21 d。除空白組大鼠每籠5只外，其它組大鼠均單籠飼養(yǎng)。除空白組外，其它組大鼠每日接受1種刺激。刺激方式經(jīng)過稍微調(diào)整，包括冰水游泳(4℃，5 min)、熱應(yīng)激(45 ℃，5 min)、搖晃(1 次/s，15 min)、夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(48 h)、晝夜顛倒、限制(2 h)和電擊足底(36 V，10 s/次，1 次/min，30 次)。每種刺激平均給予2～3次，隨機安排，使大鼠不能預(yù)知下次刺激的種類。實驗前1 d和實驗開始后每周的固定時間對大鼠進行糖水喜好實驗和敞箱實驗。①糖水喜好實驗:CMS實驗中所有大鼠均參與糖水喜好實驗，并且實驗中均單籠測試。在進行實驗前，每個籠子給予兩瓶水進行適應(yīng)性訓(xùn)練，1瓶是清水，另外1瓶是1%的蔗糖水溶液，訓(xùn)練時間是48 h。實驗前所有大鼠給予斷水?dāng)嗍?3 h處理，然后每籠放入以上兩種液體，測試時間為1 h。通過稱量實驗前后瓶的重量來計算糖水飲用量和清水飲用量，并計算糖水消耗率:糖水消耗率=糖水飲用量/(清水飲用量+糖水飲用量)×100%。實驗均在每周固定的日子(星期五)和固定的時間(上午9:00～10:00)進行。②敞箱實驗:敞箱實驗是用來觀察動物的自主活動、對新奇環(huán)境探測行為的1種實驗方法［3］。為評價模型的效果，在CMS實驗前1天及CMS實驗過程中每周的固定時間對所有動物進行敞箱實驗。分組情況見CMS實驗，觀察指標(biāo)有:a.水平得分，動物每3只腳進入1格得1分;b.垂直得分，動物前肢同時離地(洗臉等清潔動作除外)得1分。每只動物觀察時間均為5 min，完畢后均對敞箱進行徹底清掃以消除氣味所帶信息對下1只實驗動物造成的影響。房間保持安靜，實驗均在暗室中進行，敞箱上方距離45 cm處掛1個45 W的燈泡。為保證實驗數(shù)據(jù)的客觀性，實驗中采用盲法進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Access數(shù)據(jù)庫軟件平行雙人錄入數(shù)據(jù)，以SAS 9.13統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1對小鼠懸尾實驗(TST)和強迫游泳實驗(FST)的影響 如表1所示，在小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗中，同空白組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組與陽性對照組的不動時間均明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 小鼠TST和FST實驗中人參皂苷Rb1作用后不動時間的改變(n=12±s)

表1 小鼠TST和FST實驗中人參皂苷Rb1作用后不動時間的改變(n=12±s)

* 與空白對照組相比，P＜0.05，＊＊與空白對照組相比，P＜0.01。

劑量(mg/kg)不動時間(s)TST FST空白組97.33 ±11.40 134.68 ±14.53陽性對照組 31.58±4.45＊＊ 83.77±14.20＊＊1.25 54.56 ±8.03＊＊ 122.60 ±20.34*2.50 49.74 ±6.04＊＊ 114.08 ±17.02＊＊5.00 36.23 ±5.04＊＊ 95.83 ±10.65＊＊

2.2 人參皂苷Rb1對大鼠強迫游泳實驗的影響 如表2所示，在大鼠強迫游泳實驗中，同空白組相比，人參皂苷Rb1低、中、高劑量組與陽性對照組均顯著縮短大鼠不動時間，并延長開始出現(xiàn)不動狀態(tài)的潛伏期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 大鼠FST實驗中人參皂Rb1作用后不動時間及不動潛伏期的改變(n=10±s)

表2 大鼠FST實驗中人參皂Rb1作用后不動時間及不動潛伏期的改變(n=10±s)

* 與空白對照組相比，P ＜0.05，＊＊與空白對照組相比，P ＜0.01。

劑量(mg/kg)不動時間(s)潛伏期(s)104.00 ±11.00 24.60 ±5.53陽性對照組 42.11±5.58＊＊ 131.56±26.50＊＊1.25 72.70 ±8.27* 50.80 ±8.10*2.50 65.40 ±8.85* 66.10 ±10.01*5.00 47.00 ±6.36＊＊ 69.43 ±8.31空白組*

2.3 人參皂苷Rb1對大鼠敞箱實驗的影響 表3顯示，CMS逐漸降低了動物的自主活動，表現(xiàn)為第2周和第3周的水平得分顯著降低，同正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在第3周，中劑量和高劑量的人參皂苷Rb1顯示出對這種降低的減緩作用，同CMS組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表4顯示，CMS逐漸降低了動物對新奇環(huán)境的探測行為，從第1周開始顯著降低了動物的垂直得分，同正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。從第2周開始，高劑量的人參皂苷Rb1顯示出對這種降低的減緩作用，而中劑量則在第3周末顯示出這種作用，同CMS組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量的人參皂苷Rb1在敞箱實驗中沒顯示出對CMS所致的行為學(xué)改變具有改善作用。陽性對照藥丙咪嗪從第2周開始顯示出了抗CMS誘導(dǎo)的行為學(xué)改變作用，同CMS組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 敞箱實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠水平得分的降低(n=10，±s)

表3 敞箱實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠水平得分的降低(n=10，±s)

#與空白對照組相比，P＜0.05，##與空白對照組相比，P＜0.01;*與CMS模型組相比P＜0.05，＊＊與CMS模型組相比P＜0.01。

組別 劑量(mg/kg)水平得分實驗前 1周 2周 3周空白對照組 0 47.20 ±8.23 44.00 ±8.24 44.10 ±8.11 42.70 ±6.＊＊03 CMS 模型組 0 44.80 ±5.68 34.40 ±8.65 29.20 ±5.26# 25.70 ±5.83##陽性對照組 15 42.00 ±6.29 39.30 ±6.34 39.00 ±6.66 39.40 ±7.36＊＊低劑量組 1.25 47.00 ±7.65 36.20 ±7.89 34.40 ±7.35 33.60 ±6.36中劑量組 2.50 46.00 ±8.26 38.70 ±8.94 37.60 ±9.65 36.00 ±8.97*高劑量組 5.00 46.40 ±5.54 39.30 ±7.78 39.60 ±6.96 38.90 ±7.18

表4 敞箱實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠垂直得分的降低(n=10，s)

表4 敞箱實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠垂直得分的降低(n=10，s)

#與空白對照組相比，P＜0.05，##與空白對照組相比，P＜0.01;* 與 CMS模型組相比 P＜0.05，＊＊與 CMS模型組相比 P＜0.01。

組別 劑量(mg/kg)水平得分實驗前 1周 2周 3周空白對照組 0 10.40 ±2.00 10.90 ±2.12 10.10 ±2.15 9.90 ±1.63 CMS 模型組 0 9.60 ±1.70 7.70 ±1.56# 6.10 ±1.70## 5.10 ±1.57##陽性對照組 15 10.20 ±1.62 9.50 ±2.71 9.40 ±2.00* 9.20 ±1.82＊＊低劑量組 1.25 10.60 ±1.72 8.40 ±1.34 7.90 ±1.38 7.20 ±1.82中劑量組 2.50 9.80 ±2.33 8.80 ±1.90 8.80 ±1.97 8.60 ±1.69*高劑量組 5.00 10.00 ±1.59 9.30 ±2.30 9.20 ±1.39* 9.10 ±1.11＊＊

2.4 人參皂苷Rb1對糖水喜好實驗中糖水消耗率的影響 表5顯示，CMS從第2周開始顯著降低了動物的糖水消耗率，從71.78%下降到46.32%，同正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中、高劑量的人參皂苷Rb1從第2周開始顯著逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的動物糖水消耗率的降低，同CMS組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而低劑量的人參皂苷Rb1在第3周才顯現(xiàn)出這種效應(yīng)。陽性對照藥丙咪嗪同人參皂苷Rb1具有相似的作用。

表5 糖水喜愛實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠糖水消耗率的降低(n=10，s)

表5 糖水喜愛實驗中人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的大鼠糖水消耗率的降低(n=10，s)

##與空白對照組相比，P＜0.01;*與CMS模型組相比P＜0.05，＊＊與CMS模型組相比P＜0.01。

組別 劑量(mg/kg)糖水消耗率%實驗前 1周 2周 3周06 CMS 模型組 0 71.78 ±6.43 52.17 ±7.40 47.56 ±7.75## 46.32 ±7.36##陽性對照組 15 73.59 ±4.40 62.58±7.90 67.46±5.15＊＊ 69.19±4.60＊＊低劑量組 1.25 70.98 ±5.83 53.46 ±5.46 58.45 ±5.19 60.41 ±7.56*中劑量組 2.50 72.25 ±7.33 54.86 ±9.56 61.96 ±11.56* 62.87 ±6.14＊＊高劑量組 5.00 71.32 ±4.38 56.76 ±8.17 63.71 ±6.87* 65.64 ±6.88空白對照組 0 71.10 ±7.11 63.51 ±6.45 66.74 ±6.40 67.38 ±6.＊＊

3 討論

通過一系列動物抑郁模型實驗發(fā)現(xiàn):1.25 mg/kg、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg 3種劑量的人參皂苷Rb1可以劑量依賴性地降低動物的不動時間，并且連續(xù)給藥21 d可以逆轉(zhuǎn)不可預(yù)測性的中度慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的一些行為學(xué)的改變。這些結(jié)果同陽性對照藥物丙咪嗪相似，顯示了人參皂苷Rb1具有抗抑郁的作用。

強迫游泳實驗和懸尾實驗是目前被廣泛應(yīng)用的兩種動物抑郁模型實驗，反映出一種被稱之為行為絕望(behavioral despair，BD)狀態(tài)［4，5］，不動狀態(tài)持續(xù)的時間即不動時間被用來評價抑郁的程度。大量研究顯示，嚙齒類動物給予抗抑郁癥藥物處理后，可降低不動時間。這種行為絕望模型被廣泛用于抗抑郁藥物的初篩和藥理學(xué)評價實驗。但這兩個模型是非特異性的抑郁模型，結(jié)合敞箱實驗則可有效排除假陽性現(xiàn)象。在本實驗中，小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗為急性實驗，單次給藥30 min后開始測定指標(biāo)，結(jié)果顯示，3種劑量的人參皂苷Rb1劑量依賴性地降低了不動時間。

在大鼠強迫游泳試驗中，考慮到動物種系的差異，并且有文獻報道，強迫游泳實驗中動物對抗抑郁劑的處理可能有一個亞慢性的反應(yīng)［6］，因此本實驗在原來單次給藥的基礎(chǔ)上又連續(xù)給藥6 d，采取了亞慢性的給藥方法，結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1呈劑量依賴性的降低了不動時間，延長了大鼠出現(xiàn)絕望狀態(tài)的潛伏期，與陽性對照藥物丙咪嗪具有相似的作用，據(jù)此可以推測人參皂苷Rb1可能具有抗抑郁的作用。

慢性中度應(yīng)激(CMS)模型是模仿人類而設(shè)計的。當(dāng)給予動物幾周不可預(yù)測性的應(yīng)激原時，動物將會顯示一系列的行為學(xué)方面的改變，包括喜好、自主活動及探測行為的改變等等。在CMS誘導(dǎo)的這些行為學(xué)改變中，動物糖水消耗的降低被認為是一項非常可靠的行為學(xué)測定方法，因為它與抑郁癥患者所表現(xiàn)出的快感缺失癥狀非常相似。大量研究顯示，三環(huán)類抗抑郁藥或5-羥色胺再攝取抑制劑均可以逆轉(zhuǎn)CMS誘導(dǎo)的動物糖水消耗的降低［7］。本次實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過3周的連續(xù)給藥后，3種劑量的人參皂苷Rb1逆轉(zhuǎn)了CMS誘導(dǎo)的糖水消耗的降低，呈現(xiàn)出抗抑郁的作用。

敞箱實驗中的行為評定是檢測動物的自主活動能力以及對新奇環(huán)境的探究行為。但一些具有中樞興奮性的藥物在抗抑郁癥的動物行為學(xué)實驗中同樣可以產(chǎn)生類似于抗抑郁的作用，產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。在所有實驗前我們做了一次敞箱實驗，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1在實驗所用的劑量下沒有中樞興奮作用，排除了假陽性的可能，保證了后續(xù)實驗中數(shù)據(jù)的可靠性。在21 d的不可預(yù)測性慢性中度應(yīng)激模型中我們發(fā)現(xiàn)，隨著用藥時間的增加，2.5 mg/kg和5.0 mg/kg兩個劑量的人參皂苷Rb1可以逆轉(zhuǎn)CMS誘導(dǎo)的水平和垂直得分的降低，低劑量雖然沒有顯著作用，仍能看出有這種趨勢，提示了該藥物具有抗抑郁的作用。

總的來說，一系列動物抑郁模型實驗結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1在行為學(xué)上具有抗抑郁作用，為今后抗抑郁癥藥物的開發(fā)及其抗抑郁作用機制的探索提供了一定的實驗依據(jù)。

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