聚乙二醇修飾對(duì)固體脂質(zhì)納米粒胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)消除的影響

高 哲，陳 建

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，杭州 310003)

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是繼微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒之后，發(fā)展起來(lái)的一種新型毫微粒類(lèi)給藥系統(tǒng)。它具有物理穩(wěn)定性高、可以控制藥物的釋放、避免藥物的降解或泄漏的優(yōu)勢(shì)，毒性低、生理相容性好，是一種很有發(fā)展前景的藥物給藥系統(tǒng)［1-3］。但SLN在體內(nèi)對(duì)單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system，MPs)有趨向性，使其在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system，RES)的分布增加，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間減少［4］。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾SLN可以提高SLN在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，減慢消除［5］。然而對(duì)于口服 PEG修飾 SLN后對(duì)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)合成熒光標(biāo)記不同含量和聚合度PEG-SLN，以SD大鼠為模型，檢測(cè)口服PEG-SLN后在體內(nèi)濃度變化，以期系統(tǒng)闡明PEG對(duì)SLN在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)消除的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

硬脂酸(stearic acid，SA，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)，聚乙二醇-硬脂酸酯(PEG-SA，Kasei Kogy Co.，Japan)，硬脂胺-異硫氰基熒光素嫁接物(Octadecylamine-fluorescein isothiocyanate，ODA-FITC，自備，制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6］)，SD大鼠(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，其他溶劑和試劑均為色譜純或分析純。熒光分光光度計(jì)(F-2500，HITACHI Co.，Japan)，微粒粒度及表面電位分析儀(Zetasizer 3000HS，Malvern，UK)，冷凍干燥機(jī)(Freezone 2.5 plus，Labconoco Co.，USA)，核 磁 共 振 儀 (AC-80， BrukerBiospin，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 熒光標(biāo)記PEG-SLN的制備 精密稱(chēng)取硬脂酸60 mg，ODA-FITC 熒光嫁接物4.8 mg，PEG 2000-SA(使與硬脂酸的比例分別為 0.67%、1.3%、2.0%、2.6%，mol/mol)，或不同聚合度的PEG-SA適量(使PEG1300-SA、PEG 2000-SA和PEG2700-SA與硬脂酸的比例均為1.3%，mol/mol)，加入無(wú)水乙醇6 mL，超聲使完全溶解。以蒸餾水為分散介質(zhì)，在70℃水浴、400 r/min機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相迅速注入60 ml分散介質(zhì)中，得PEG修飾熒光標(biāo)記SLN分散液。以鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.2，使納米粒絮凝，微孔濾膜過(guò)濾得到納米粒沉淀。將納米粒沉淀再分散至3 ml 0.1% 泊洛沙姆188溶液中，探頭超聲處理，得到熒光標(biāo)記不同修飾比例PEG2000-SLN和不同聚合度PEG-SLN再分散液。

1.2.2 PEG-SLN核磁共振試驗(yàn)和修飾率 取適量PEG-SLN溶于氘代氯仿中，作核磁共振檢測(cè)得PEGSLN的核磁共振氫譜。對(duì)PEG特征1H峰(化學(xué)位移3.7)和 CH3特征1H峰(化學(xué)位移0.8)進(jìn)行積分，并根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算PEG含量摩爾百分比和修飾率:

1.2.3 PEG-SLN粒徑和 Zeta電位 取 PEG-SLN再分散液，以蒸餾水稀釋400倍，用微粒粒度與Zeta電位測(cè)定儀測(cè)定平均粒徑和Zeta電位。

1.2.4 PEG-SLN血樣測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 取適量PEG-SLN加至血液(含有肝素溶液抗凝)中形成脂質(zhì)濃度為200 μg/ml的分散液。移取適量，用全血稀釋至脂質(zhì)濃度為 5、10、25、50、100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)分散液，水浴37℃孵育5 min，加入同等體積乙腈，漩渦振蕩3 min混勻，8 000 r/min，離心半徑6 cm，離心10 min后取上清液，熒光分光光度法(Ex:495 nm，Em:514 nm，slit:5 nm)測(cè)定，根據(jù)熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 PEG-SLN口服后胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和體內(nèi)消除取SD大鼠若干，隨機(jī)分為兩組，使每組大鼠為10只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。按照150 mg PEG-SLN/kg的劑量分別給各實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃不同比例修飾(PEG2000-SA，0.67%、1.3%、2.0%，mol/mol)和不同聚合度(PEG1300-SA、PEG2000-SA，PEG2700-SA，1.3%，mol/mol)PEG修飾的SLN再分散液，分別于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 從尾靜脈取血，肝素抗凝，按照1.2.4 法分析測(cè)定。

2 結(jié) 果

PEG-SLN核磁共振氫譜，見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，經(jīng)PEG(Mw 1 300、2 000、2 700)修飾后的 SLN 圖譜中同時(shí)有硬脂酸分子中基團(tuán)特征峰(化學(xué)位移0.8)和PEG-SA分子中(CH2CH2O)基團(tuán)特征峰(化學(xué)位移3.7)，證明PEG已修飾到SLN表面。

不同投量和聚合度PEG在SLN中修飾率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖2。采用溶劑擴(kuò)散法制備對(duì)PEG-SA具有較高的修飾率。由圖可見(jiàn)，PEG投量提高，PEG修飾率穩(wěn)定為72%，當(dāng)PEG投量增加到2.6%，mol/mol時(shí)，修飾率下降至58%，說(shuō)明采用溶劑擴(kuò)散法制備SLN對(duì)PEG-SA的包載有飽和趨勢(shì)。PEG聚合度提高，修飾率略有下降，可能因?yàn)镻EG的聚合度越大，空間位阻和在水中的運(yùn)動(dòng)黏度也就越大，不利于SLN對(duì)PEG的包裹。

以溶劑擴(kuò)散法制備的PEG-SLN，粒徑和電位考察結(jié)果見(jiàn)表1。由表可見(jiàn)，隨著制備處方中 PEG 2000-SA用量的增加，SLN粒徑從200.3 nm逐漸增至306.3 nm。當(dāng)PEG聚合度(Mw)逐漸變大，PEGSLN粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化。SLN未經(jīng)PEG修飾的粒徑約為200 nm，PEG鏈長(zhǎng)的改變對(duì)SLN粒徑影響不明顯。SLN的粒徑主要由所選用的脂質(zhì)材料和制備方法本身性質(zhì)所決定。

各組的Zeta電位都也比較接近，約為－24 mv左右。

表1 不同修飾比例、不同聚合度PEG-SLN的粒徑和Zeta電位Tab.1 Different modification proportion，different degree of polymerization PEG-SLN particle size distribution and Zeta potential

PEG修飾的SLN在血液中的平均回收率為32.1%，RSD＜15%，具有良好的重現(xiàn)性。精密度測(cè)定RSD＜15%，該血樣處理方法滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

PEG-SLN在血樣中標(biāo)準(zhǔn)曲線考察結(jié)果。由圖可見(jiàn)，PEG-SLN在血樣中的線性方程分別為Y=3.56 x －0.18(PEG2000-SA，0.67%，mol/mol)、Y=4.62x+8.11(PEG2000-SA，1.3%，mol/mol)、Y=6.96x － 7.51(PEG2000-SA，2.0%，mol/mol)、Y=7.06x+7.61(PEG1300-SA，1.3%，mol/mol)和 Y=10.68x+1.84(PEG2700-SA，1.3%，mol/mol)。線性良好(r＞0.99)，線性范圍均為5 ～100 μg/ml。

大鼠口服不同含量(0.67%、1.3%、2.0%，mol/mol)PEG修飾SLN后的體內(nèi)濃度變化曲線見(jiàn)圖3。由圖可見(jiàn)，PEG含量越低，口服1～2 h后SLN濃度越高，說(shuō)明PEG含量提高不利于SLN的胃腸道吸收。因?yàn)镻EG含量增加，覆蓋于SLN表面的PEG側(cè)鏈越多，越不利于SLN的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，使吸收速率降低。至8 h，PEG含量越高，其體內(nèi)的消除速度越慢，說(shuō)明PEG含量的提高有助于提高SLN的體循環(huán)時(shí)間。

大鼠口服不同聚合度(Mw 1 300、Mw 2 000、Mw 2 700)PEG修飾SLN后的體內(nèi)濃度變化曲線見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，PEG聚合度越大，在口服后1～4 h，SLN濃度越小，說(shuō)明PEG聚合度越大對(duì)SLN在胃腸道內(nèi)吸收有阻礙。至12 h，PEG聚合度越大，SLN消除越慢，表明PEG聚合度變大有利于PEG-SLN的“隱匿”。

3 討 論

本研究采用了一種新型的合成熒光素嫁接物——硬脂胺-異硫氰基熒光素作為熒光標(biāo)記物。在N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF)中，硬脂胺的氨基能與異硫氰基熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)發(fā)生加成反應(yīng)，形成 ODA-FITC。由于硬脂胺-FITC的疏水鏈和硬脂酸性質(zhì)相近，具有較強(qiáng)親和力，使兩者能夠緊密結(jié)合，不易分離，是理想的硬脂酸SLN熒光標(biāo)記物［6］。

通過(guò)水性溶劑擴(kuò)散法制備得到的PEG-SLN，其平均粒徑為200.3 ～306.3 nm，表面電位約為 －24 mv，與未經(jīng)修飾的SLN相比，變化不顯著。由于PEG親水性較強(qiáng)，故在溶劑擴(kuò)散法制備過(guò)程中更易趨向于極性較大的水性溶劑而富集于脂質(zhì)表面。經(jīng)核磁共振考察確認(rèn)PEG成功嫁接到SLN表面。當(dāng)PEG-SA的投量在12 wt%以下時(shí)，PEG修飾率穩(wěn)定在72%，說(shuō)明通過(guò)溶劑擴(kuò)散法制備PEG-SLN有效而簡(jiǎn)便。

先前的研究已發(fā)現(xiàn)，PEG-SLN體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間較未經(jīng)PEG修飾的SLN大大延長(zhǎng)，具有長(zhǎng)循環(huán)作用，而SLN主要通過(guò)淋巴吸收途徑進(jìn)入體循環(huán)［5］。外源性脂質(zhì)通常在小腸內(nèi)水解成脂肪酸和甘油酯，由腸黏膜一些脂蛋白結(jié)合形成乳糜微粒(CM)后，經(jīng)淋巴吸收。脂質(zhì)在淋巴液中的溶解度是影響淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)效率和速度的重要因素［7-8］。PEG作為一種親水性較強(qiáng)的長(zhǎng)鏈聚合物，對(duì)SLN修飾后使SLN表面親水性增強(qiáng)，不利于SLN對(duì)脂蛋白的吸附，使SLN在淋巴液中溶解度降低，阻礙SLN的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致SLN胃腸道吸收速度下降。PEG的含量越高，聚合度越大，胃腸道的吸收速度越低。

經(jīng)PEG修飾后微粒在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)作用，主要與PEG修飾后SLN可以避免調(diào)理素等識(shí)別，防止被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的攝取有關(guān)［9］。本研究表明，SLN表面PEG的含量越高，聚合度越大，其干擾蛋白吸附到SLN表面的能力越強(qiáng)，更有效地避免SLN被巨噬細(xì)胞吞噬。SLN中PEG含量和聚合度改變對(duì)藥物的釋放影響同樣明顯。已有報(bào)道，微粒中PEG含量的增大使藥物的前期突釋更為嚴(yán)重，釋放的速率更快。主要由于PEG可以在微粒中構(gòu)成一種分子核或分子通道，更有利于藥物的擴(kuò)散。PEG含量越多，這樣的分子核或分子通道也就越多，則藥物釋放越快［10］。

綜上所述，PEG含量和聚合度提高會(huì)減慢SLN在胃腸道內(nèi)吸收，延長(zhǎng)SLN體循環(huán)時(shí)間，加快藥物的釋放。因而對(duì)SLN進(jìn)行PEG修飾須綜合考慮吸收、藥物釋放以及體內(nèi)循環(huán)時(shí)間等多方面因素，根據(jù)實(shí)際所載藥物特性，選擇一個(gè)最佳PEG聚合度和投量比例。

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