新型骨顯像劑99Tcm－BIPr DP的制備及其反應動力學研究

張 姝，羅世能，邱 玲，林建國，夏詠梅

（1.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫 214063）

自20世紀70年代初用99Tcm標記的親骨顯像劑問世以來，放射性核素骨顯像已被廣泛應用，并成為核醫(yī)學科的一個重要分支［1］。目前臨床上使用的骨顯像劑主要是99Tcm標記的雙膦酸鹽類，其中以99Tcm－MDP 應用最為廣泛［2］，它具有親骨特異性強、血液清除率快、骨顯影清晰、毒性低、不被肝臟攝取等優(yōu)點，但其在體內代謝較慢，給藥后需要3～4h才能顯像［3］。

唑來膦酸是分子內含有咪唑基的第3代雙膦酸鹽類藥物的代表，該藥主要用于治療腫瘤引起的高鈣血癥、骨轉移和老年骨質疏松癥及預防骨轉移患者的并發(fā)癥，是目前臨床試驗中作用最強的雙膦酸鹽化合物［4］。用99Tcm標記唑來膦酸鹽類藥物進行骨顯像，1h后即可得到清晰的骨顯 像［5，6］，與99Tcm－MDP 相 比，99Tcm標 記 唑來膦酸鹽類藥物大大縮短了顯像等待時間。然而前期研究表明，該類顯像藥物雖然有較高的骨攝取，但在肝、脾、肺和腎的吸收均很高，且清除速率較慢，對人體健康不利［2］。近年來，本研究小組報道了用99Tcm標記唑來膦酸衍生物如MIDP［7］、EIDP［8］、PIDP［9］和i－PIDP［5］，并 探 索了其進行骨顯像的可能性。結果顯示，室溫下標記率均可達到90%以上；當咪唑環(huán)上的2位上引入烷基取代基時，其顯像效果明顯提高，肝、脾、肺的吸收明顯降低，只有腎的吸收較高，可以說明該藥物主要經腎代謝，通過尿液排出體外，對人體其他組織傷害較小。

最近本研究小組制備出了一種新型的唑來膦酸衍生物：1－羥基－3－（2－丁基－1H －咪唑－1基）丙烷－1，1－雙膦酸（BIPrDP），它是在唑來膦酸的基礎上，對其結構進一步優(yōu)化，在咪唑環(huán)的2位上引入丁基取代基，并將與雙膦酸基團相連碳的個數由2增加到了3。用Na99TcmO4對BIPrDP進行標記時，發(fā)現該化合物在室溫下標記率很低，不能滿足要求。為此，本課題組進一步研究了99Tcm－BIPrDP制備反應動力學性質。通過標記反應動力學的研究，旨在揭示反應溫度和時間對99Tcm－BIPrDP 制 備 的 影響，為99Tcm－BIPrDP的制備提供理論依據，也為該類99Tcm標唑來膦酸類放射性藥物今后在臨床上的推廣應用提供重要的指導信息。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

2－丁基咪唑：上海翰鴻化工科技有限公司；溴丙酸乙酯：上海邦成化工有限公司；Na99TcmO4淋洗液：江蘇省原子醫(yī)學研究所附屬江原醫(yī)院提供；氫氧化鉀、碳酸鉀、四丁基溴化胺、三氯化磷、磷酸、鹽酸、氯化亞錫均為中國醫(yī)藥集團上海試劑公司。

1.2 主要儀器

Yanadimoto型熔點儀：日本島津公司；WatersPlatform ZMD4000型質譜儀：美國 Waters公司；Bruker AM400型核磁共振儀：Bruker光譜儀器公司；γ計數儀：Perkins Elmer儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 BIPrDP的合成

在參閱文獻［10－12］的基礎上，對唑來膦酸進行結構改進，自行設計合成BIPrDP，具體合成線路示于圖1。采用 MS、1H－NMR和元素分析方法對目標物和中間體進行結構鑒定。

2.1.1 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸乙酯（b）的合成 向250mL三口燒瓶中加入12.4g（0.1mol）2－丁基 咪 唑 （a）、13.8g（0.1mol）K2CO3、8.4g（0.15mol）KOH、0.8g（0.002 5mol）四 丁 基 溴 化 銨 和 100mL CH2Cl2，室溫下攪拌0.5h。用恒壓漏斗向燒瓶中緩慢滴加12.7mL（0.1mol）溴丙酸乙酯，在50℃油浴下反應20h。過濾，濾餅用50mL CH2Cl2洗滌3次。濾液再用飽和NaCl溶液洗3次，取CH2Cl2層，減壓濃縮，除去CH2Cl2，得到紅褐色黏稠液體b，此物質未經進一步純化，直接用于下一步反應。

2.1.2 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸（c）的合成 將上述紅褐色黏稠液體b加入250mL燒瓶中，再加入100mL H2O和固體NaOH調反應液pH為13～14，加熱至110℃，反應7h。待反應充分后加入2g活性炭脫色30min，趁熱抽濾得棕褐色水溶液，加濃鹽酸調其pH為1～2，減壓蒸去溶劑，有大量白色固體析出。在白色固體中加乙醇，過濾將白色物質除去，再將濾液減壓旋蒸，得深黃色黏稠狀液體。將液體倒入研缽，加少許石油醚研磨，有淺黃色固體出現，干燥后用異丙醇重結晶，真空干燥得白色晶體c。

2.1.3 1－羥基－3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙烷－1，1－雙膦酸（BIPrDP）的合成 于100mL三頸燒瓶中加入3.92g（0.02mol）c、5.0mL質量分數為85%H3PO4和15mL氯苯，混勻后加熱至110℃，攪拌1h后降溫至65℃，緩慢滴加7.8mL三氯化磷，約30min滴加完畢，升溫到120℃，反應8～10h，至下層呈粘稠狀攪不動時，停止反應。反應液冷卻至室溫，倒去上層氯苯，在100℃下加入30mL 9mol／L的 HCl水解7h。反應結束后，過濾，除去黃色雜質，濾液呈黃色，用2～3g活性炭脫色，在100℃下脫色30min。過濾除去活性炭，得到淺黃色澄清透明的液體。將濾液旋轉蒸發(fā)，得到少許淺黃色油狀物，待冷卻后，向冷的乙醇中倒入反應液，有白色固體析出，攪拌4h后抽濾，得白色固體，干燥后用水重結晶，真空干燥得白色固體d。

2.2 99Tcm－BIPrDP的制備

99Tcm－BIPrDP 的 合 成 過 程 示 于 圖 2。 取250mg BIPrDP，用1mL 0.1mol／L的 NaOH溶液溶解，加水稀釋至5mL，配成50g／L的BIPrDP鈉鹽溶液，pH 約為6；將10mg SnCl2·2H2O溶于10mL的0.5mol／L的鹽酸中，配成1g／L SnCl2·2H2O溶液。

圖1 BIPrDP的合成路線

圖2 99Tcm－BIPrDP的合成

分別在40、50、60、70、80和90 ℃下，在10mL西林瓶中加入100μL BIPrDP鈉鹽溶液、100μL新鮮配制的SnCl2的鹽酸溶液、1.8mL pH為6的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和新鮮淋洗的Na99TcmO4溶液（37.0MBq）。

2.3 標記率的測定

采用TLC法，以新華一號層析紙為支持物，雙體系為展開劑，體系1為丙酮，體系2為水，展開后用γ計數儀測量各部分計數，進而計算出標記率。

99Tcm－BIPrDP在丙酮中Rf＝0～0.1，在水中Rf＝0.8～1.0，99TcmO2在丙酮和水中的Rf＝0～0.1，游離99TcmO4－在丙酮和水中的Rf＝0.9～1.0。

2.4 反應速率常數

99Tcm與 BIPrDP的反應如下式［13－16］所示：

假設反應為二級反應，則99Tcm（BIPrDP）2（OH）2的生成反應速率可以表示為：

其中，a＝ ［99Tcm］0；b＝ ［BIPrDP］0；x＝［99Tcm（BIPrDP）2（OH）2］；k為反應速率常數；t為反應時間。

對（1）式積分得，

因為b ≈ 10－2～10－3mol／L，a ≈ x ≈10－8～10－9mol／L，即b?a≈x，b－2x ≈b，b－2a≈b。因此（2）式可簡化為：

x／a為標記率RLY，它可通過放射性測量得到，故可將（3）式改寫為

2.5 反應活化能

反應活化能與反應速率常數和反應溫度均有關系，這種關系可用阿倫尼烏斯（Arrhenias）方程表示［13］：

將（5）式兩邊取對數得

其中，Ea為反應活化能；A為頻率因子；T為絕對溫度；R 為氣體常數（8.314J·mol－1·K－1）。

3 結果與討論

3.1 BIPrDP的表征

共經過三步反應，得到白色固體，總產率為23.6% 。mp：148～150 ℃。ESI－MS（m／z）：343（M＋）。1H NMR（400MHz，D2O）：δ7.35（d，1H，CH－ring），δ7.23（d，1H，CH－ring），δ4.36～4.40（t，2H，NCH2），δ2.92～2.95（t，2H，CH2CH2CH2CH3），δ2.32～2.43（m，2H，NCH2CH2，JC－P＝13.79Hz），δ1.64～1.71（m，2H，CH2CH2CH3），δ1.27～1.35（m，2H，CH2CH3），δ0.83～0.86（t，3H，CH2CH3）。C10H20N2O7P2元素分析值 （計算值）／%：C，35.06（35.10）%；H，5.92（5.89）%；N，8.17（8.19）%。以上數據說明合成的產物為設計合成的化合物BIPrDP。

3.2 標記率與反應時間的關系

不同溫度下標記率與反應時間的關系示于圖3。由圖3可以看出，反應溫度對99Tcm－BIPrDP的標記率影響很大。在40℃時，反應達到平衡時標記率僅為約50%；在60℃時，達到75%左右；只有當溫度升高到90℃時，反應平衡時的標記率才能明顯超過90%。另外，由圖3也可以看出，雖然在不同的溫度下，99Tcm－BIPrDP的最大標記率有很大的不同，但它們所達到平衡的時間卻比較相近，均是在幾十秒內完成。這種關系，可以依據物理化學中的化學反應動力學和化學反應熱力學知識加以進一步研究。

3.3 反應速率常數的計算

由反應速率常數推導出的（4）式表明，以ln（1－RLY）－1對t作圖應得一直線，直線斜率為K，結果示于圖4。對圖4進行線性擬合，可知，在6個不同溫度下，ln（1－RLY）－1與t都呈良好的線性關系。40 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.018 3t＋0.329，r2＝0.980 4；50 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.020 7t＋0.723，r2＝0.996 1；60 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.024 1t＋0.872，r2＝0.990 5；70℃時，ln（1－RLY）－1＝0.027 0t＋1.041，r2＝0.993 7；80 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.028 8t＋1.814，r2＝0.986 7；90 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.031 9t＋2.261，r2＝0.999 3。

圖3 標記率（RLY）與反應時間的關系

各溫度下直線的斜率即為該溫度下的反應速率常數，即在40、50、60、70、80和90℃下的反應速率常數k分別為0.018 3、0.020 7、0.024 1、0.027 0、0.028 8和0.031 9。

圖4 ln（1－RLY）－1和反應時間（t）的關系圖

將溫度從40℃升高到60℃，反應速率常數k增大了約1.32倍；將溫度從50℃升高到70℃、60℃升高到80℃和70℃升高到90℃時，反應速率常數k分別增大了約1.30倍、1.20倍和1.18倍。這表明在低溫下升高反應溫度比在高溫下升高反應溫度對反應速率的影響要大一些。

99Tcm－BIPrDP的制備反應是一個較為復雜的反應，包含著還原反應和配合反應。首先SnCl2把锝從高價還原到低價，在還原反應中，99TcmO4－的初始濃度為a≈10－8～10－9mol／L，SnCl2的濃度約為10－3～10－4mol／L，SnCl2的用量較99TcmO4－大幅過量，99Tcm卻能以極高的標記率穩(wěn)定住相應標記物的氧化態(tài)，該溶液中的99Tcm僅有3%以下被還原分解為99TcmO2等雜質［17］，說明此還原反應發(fā)生很快，而且轉化率大于97%；之后低價99Tcm再和BIPrDP發(fā)生絡合反應，BIPrDP的初始濃度為b≈10－2～10－3mol／L，b?a，符合準一級反應條件，在整個反應過程中BIPrDP的濃度可視為常數，可并入速率常數項，則此反應可稱為準一級反應［18］。

3.4 反應活化能的計算

根據（6）式可以看出，以lnk對1／T作圖應是一條直線，斜率為－Ea／R，由斜率可以求出反應活化能Ea。lnk與1／T的關系示于圖5。圖5顯示，lnk與1／T之間存在著良好的線型關系，采用最小二乘法進行線性回歸，得到lnk與1／T的線性方程為：

由式（7）可以求得反應活化能 Ea：Ea＝－1 267.1×（－8.314）＝10.53kJ·mol－1。

圖5 lnk與1／T的關系

與一般反應活化能的典型值20～150kJ·mol－1相比，99Tcm－BIPrDP的制備反應所需的活化能很低，即反應要克服的勢能壘較低，反應更易進行［19］。據文獻［20］報道，99Tcm－BIDP 的反應活化能為10.45kJ·mol－1。表明此類99Tcm標記唑來膦酸衍生物制備反應的活化能相差不大。計算出本反應的反應活化能數值較小，說明本反應的反應速率很快，也驗證了本反應在較短時間內即可達到平衡的事實。

3.5 反應熱與平衡標記率的計算

3.3節(jié)的研究結果表明，99Tcm－BIPrDP的制備反應為準一級反應，即總反應表現為對99TcmO4－是一級反應［21］。用c 表 示反應初始99TcmO4－濃度，xe表示反應達到平衡時99Tcm－BIPrDP的濃度。由于c約為10－8～10－9mol·L－1，即濃度很低，標記反應涉及的其它常量反應物和生成物的濃度及溶液的離子強度近似不變，標記反應的平衡常數Kθ可表示為99Tcm的分配比乘以一個常數Q，即Kθ＝DQ，令Kp＝Kθ／Q，則Kp＝D。

因此，該反應的平衡常數Kp表示為：

（8）式中，RLY＝xe／c表示平衡時99Tcm－BIPrDP的標記率，即在一定溫度下99Tcm－BIPrDP的最大標記率。

根據吉布斯－亥姆霍茲公式推得平衡常數Kp與反應熱△H的關系為：

式中，C為常數；R 為氣體常數（8.314J·mol－1·K－1）。在反應溫度變化不大的情況下，△H 可看成常數。將（8）式代入（9）式，得到99Tcm－BIPrDP的平衡標記率（RLY）與反應溫度的關系為：

由（10）式可以看出，ln［RLY／（1－RLY）］與1／T 存在著良好的線性關系，將40、50、60、70、80和90℃下達到平衡的ln［RLY／（1－RLY）］對1／T 作圖，可得，△H＝51.71kJ·mol－1，C＝19.84，故ln［RLY／（1－RLY）］＝－6 218.4／T＋19.84。將 RLY＝90%代入可得T＝352.46K，即T＝79.31℃。

當標記率達到90%時，最低反應溫度是79.31℃。說明滿足標記要求的最低反應溫度閾值是79.31℃。

4 小 結

99Tcm－BIPrDP的制備反應為準一級反應。99Tcm－BIPrDP的制備反應受溫度的影響較大，標記率隨著溫度的升高而逐漸變大。根據放射性藥物的臨床使用要求，放射性藥物的標記率應在90%以上，滿足這一要求的最低反應溫度閾值為79.31℃，達到平衡的時間僅為20s。與99Tcm－MIBI在100℃條件下3min達到平衡相比，99Tcm－BIPrDP達到平衡所需的時間短，應用更為方便。因此，考慮到臨床的需要、操作簡單等，只需在沸水浴（100℃）下反應片刻即可完成。

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