加減尪痹舒安對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠癥狀及血清炎癥因子的影響

趙 穎 ，王偉鋼 ★，肖 誠

（1.中日友好醫(yī)院 國際醫(yī)療部一病區(qū)，2.中日友好醫(yī)院 科研處，北京 100029）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性多關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、軟骨吸收、骨質(zhì)破壞和骨質(zhì)纖維化。RA這種以關(guān)節(jié)炎癥為主的慢性反復(fù)發(fā)作的全身性疾病，屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。本文旨在建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型[1]的基礎(chǔ)上觀察加減尪痹舒安對CIA大鼠的治療效果，并檢測其對模型鼠血清白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[2，3]、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）[4，5]水平的影響，以探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與藥品、試劑、儀器

選用160g～180g SPF級雄性Wistar大鼠 32只，由中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號：SCXK（京）（2008-0005）。 在中日友好醫(yī)院 SPF級動物室喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物室許可證號：SYXK（京）（2005-0025）。

甲氨喋呤（methotrexate，MTX）：上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號060502，用無菌蒸餾水制成水藥液，濃度為0.1mg/ml。

加減尪痹舒安的制備：川斷12g、補(bǔ)骨脂9g、炒黃柏 9g、地骨皮 9g、知母 12g、骨碎補(bǔ) 9g、赤白芍各 9g、秦艽20g、威靈仙 12g、制乳香 6g、制沒藥6g、忍冬藤20g、絡(luò)石藤20g、桑寄生20g、蠶砂10g、地鱉蟲 6g、懷牛膝 9g、青風(fēng)藤 15g、生熟地各6g，共含生藥 234g，水煎過濾，濃縮至 90ml，生藥濃度2.6g/ml。4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)試劑有牛Ⅱ型膠原（sigma公司產(chǎn)品）；弗氏不完全佐劑 （Freund’s Adjuvant incomplete，sigma公司產(chǎn)品）；醋酸（北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品）；10%中性福爾馬林 （北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品）；EDTA緩沖液 （北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品）；IL-1β、TNF-α放免試劑盒（華英生物有限公司產(chǎn)品）。

實(shí)驗(yàn)儀器：低溫冷凍離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、顯微鏡 OlympusBX-60（日本）、電子天平（1/1000，A2000S）德國產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

健康清潔級雄性Wistar大鼠32只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為4組。正常對照組、CIA模型組、加減尪痹舒安組和MTX組。

實(shí)驗(yàn)前1d用牛Ⅱ型膠原溶于0.1mol/L醋酸中，4℃冰箱過夜，按2mg/ml比例與弗氏不完全佐劑1∶1充分混和乳化。取適量牛Ⅱ型膠原溶液（濃度2mg/ml）逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，牛Ⅱ型膠原終濃度為1mg/ml。冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴入水中不擴(kuò)散為度，取乳化后的混合物按0.2ml（即200μg牛Ⅱ型膠原）/只，于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml（即100μg牛Ⅱ型膠原）/只，于尾根部皮下加強(qiáng)免疫1次。

正常對照組和CIA模型組均消毒飲用水灌胃，3ml/次，Qd，連續(xù)49d。加減尪痹舒安組以加減尪痹舒安煎液灌胃，3ml/次，Qd，連續(xù)49d。相當(dāng)于39g/kg/d。MTX組：MTX藥液以1.6mg/kg/d灌胃，3ml/次，1次/周，其余每天給予飲用水，連續(xù)49d。

1.2.2 觀察指標(biāo)

（1）一般行為表現(xiàn)：動物神態(tài)、毛色、活動情況、飲食量、大小便。（2）體重：每3d用電子天平稱量各組動物體重。（3）全身關(guān)節(jié)病變程度。按5級評分法評價(jià)，根據(jù)腫脹肢體的病變程度累及積分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）。 0 分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)及足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的部分足爪腫脹。四肢關(guān)節(jié)的積分累計(jì)即為每只大鼠的 AI。 （4）IL-1β、TNF-α：末次用藥24h以后，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛溶液按大鼠體重以0.3ml/100g予腹腔內(nèi)注射麻醉，腹主動脈抽血4～6ml，室溫靜置30min后2500r/min離心15min，用吸液管取血清，置于凍存管-20℃冰箱待測。放射酶聯(lián)免疫學(xué)方法測定血清IL-1β、TNF-α水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各樣本均數(shù)間比較進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)及體重變化

對照組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，體重不斷增加、活動自如、皮毛有光澤、精神狀態(tài)好，無異常狀態(tài)出現(xiàn)。模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、飲食減少、精神萎靡，后期可見負(fù)重困難及關(guān)節(jié)活動障礙等。加減尪痹舒安組及MTX組大鼠的飲食情況較模型組好。

表1示，造模前4組大鼠體重?zé)o顯著性差異（均P＞0.05）；給藥49d后，CIA模型組及加減尪痹舒安組大鼠體重較正常對照組顯著減輕 （P＜0.01），加減尪痹舒安組大鼠體重增加與模型組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分變化

造模后正常對照組為0，CIA模型組為9.12±2.73， 加減尪痹舒安組 6.34±3.71，MTX組 6.11±3.69。用藥組與模型、對照組相比均無顯著性差異（均 P＞0.05），但有改善趨勢。

2.3 各組血清IL-1β、TNF-α 水平

表2示，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α值與其余各組相比均顯著升高（均P＜0.01）；用藥組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。MTX、加減尪痹舒安有降低CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量的作用，能夠減輕大鼠的足爪腫脹。

表2 各組血清IL-1β、TNF-α 水平（n=8）

3 討論

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇。中醫(yī)對其治療原則包括清熱化濕通絡(luò)活血、補(bǔ)腎強(qiáng)筋。現(xiàn)代藥理研究表明此類中藥具有抗炎免疫，抗血小板聚集，促進(jìn)成骨細(xì)胞、抑制破骨細(xì)胞功能，可提高下丘腦-垂體-性腺軸的功能，調(diào)節(jié)性激素水平，符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論。

尪痹病名是焦樹德教授于80年代提出的，逐步得到中醫(yī)界認(rèn)可。補(bǔ)腎祛寒治尪湯系列方在臨床上取得了良好效果，其尪痹舒安方是以補(bǔ)腎清熱治尪湯為主加減，動物實(shí)驗(yàn)藥效學(xué)顯示其具有消腫抗炎止痛作用。加減尪痹舒安的組方是根據(jù)焦樹德教授治療尪痹（RA）的補(bǔ)腎清熱治尪湯化裁而來，是針對腎虛標(biāo)熱重證，臨床多見于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的急性期。其治療原則是補(bǔ)腎清熱、化濕疏風(fēng)、活血通絡(luò)。以朱丹溪的潛行散及焦老自擬的清熱散痹湯加補(bǔ)腎強(qiáng)骨之品組合而成，臨床應(yīng)用取得了較好的效果。同時(shí)符合現(xiàn)代藥理研究，川斷、補(bǔ)骨脂、炒黃柏、地骨皮、知母、赤白芍、秦艽、青風(fēng)藤、生熟地具有抗炎免疫作用，補(bǔ)骨脂、杜仲、牛膝、骨碎補(bǔ)具有抑制破骨細(xì)胞活性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用。

Ⅱ型膠原是目前較為公認(rèn)的關(guān)節(jié)軟骨特異性抗原。CIA動物模型是Trentham等在1977年首次建立的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎動物模型，所用的抗原是將純化的天然膠原溶于醋酸制成濃度1mg/ml的溶液，與等量的弗氏佐劑或不完全佐劑混合成穩(wěn)定的乳劑[6，7]。大量研究表明，CIA模型在臨床癥狀病理表現(xiàn)方面都與RA極為相似。CIA模型已成為研究RA常用的實(shí)驗(yàn)動物模型[8～10]。

RA滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過作用于多種細(xì)胞并相互調(diào)節(jié)，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了RA的發(fā)生和發(fā)展。而其中一些炎性細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1、IL-15、IL-18、IL-6、IL-12和IL-17等在RA滑膜病變中起核心作用，所以本實(shí)驗(yàn)選取了IL-1β、TNF-α這2個(gè)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：加減尪痹舒安能減輕大鼠的足爪腫脹，改善癥狀和體征，其可能的作用機(jī)制為降低大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

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