群體感應(yīng)抑制劑溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成影響的研究

張利平 王爽 周向葛 徐屹，3

（1.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學(xué)，成都 610041；2.四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，成都 610064；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 牙周科，成都 610041）

牙菌斑生物膜是牙周病的始動因子，其主要由細胞外基質(zhì)和嵌入其中的細菌組成，是細菌賴以生存和進行信號交流的場所。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細菌間進行信號傳遞的一種機制。細菌可產(chǎn)生自體誘導(dǎo)分子（autoinducer，AI），通過感知其濃度來調(diào)控周圍環(huán)境中細菌數(shù)量的變化。隨細菌密度的增加，AI的濃度不斷增加，達到一定閾值時，可以啟動細菌相關(guān)基因的表達，調(diào)控細菌生物發(fā)光、毒力因子、生物膜形成等行為[1-2]。AI-1能調(diào)控菌種內(nèi)群體感應(yīng)現(xiàn)象[3]；AI-2即呋喃酰硼酸二酯，為菌種間信號分子，它可感知菌種間細菌數(shù)量，從而調(diào)控自身行為[4-5]。牙齦卟啉單胞菌在牙周炎中的檢出率最高，是齦下菌斑中生物膜的主要組成部分，被認為是牙周炎的主要可疑致病菌。Frias等[6]研究發(fā)現(xiàn)牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、中間普雷沃菌等均產(chǎn)生AI-2。

干擾細菌QS通路可以控制細菌相關(guān)生物學(xué)行為。群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI）的研究有助于控制細菌感染。溴化呋喃酮是一種QS通路抑制劑，它可以與細菌分泌的自誘導(dǎo)物競爭性結(jié)合自誘導(dǎo)物受體，通過作用于細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)影響細菌生物膜的形成[7-8]。其對自誘導(dǎo)物AI-1、AI-2均有抑制作用[9-10]。Wu等[9]證實溴化呋喃酮能夠通過抑制自誘導(dǎo)物AI-1來抑制綠膿桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，加速清除小鼠肺部感染的綠膿桿菌，緩解病情。Defoirdt等[10]證實溴化呋喃酮還可干擾AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。本研究旨在通過光密度值測定和掃描電鏡觀察，探討溴化呋喃酮[5Z-4-溴-5溴亞甲基-2（5H）呋喃酮]在體外對牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株和培養(yǎng)基

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室提供。液體培養(yǎng)基牛心腦浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基牛心腦浸汁瓊脂培養(yǎng)基（Oxiod公司，英國）。

1.2 主要試劑和儀器

溴化呋喃酮由四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院合成、鑒定并提供。該化合物溶解于無水乙醇，-20℃保存。

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），厭氧培養(yǎng)箱（浙江義烏冷凍機總廠），麥氏細菌比濁儀（PhoenixSpec Nephelometer，BD公司，美國），掃描電鏡（scanning eletron microscope，SEM）（Inspect F，F(xiàn)EI公司，荷蘭），全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（Thermo Varioskan Flash，Thermo公司，美國），微量移液器（Gilson公司，法國）等。

1.3 菌懸液的制備

將牙齦卟啉單胞菌ATCC33277從-80℃冰箱中取出，常規(guī)復(fù)蘇，接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)（80%N2、10%H2、10%CO2）48 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。涂片檢查為純培養(yǎng)后，采用麥氏比濁儀將菌懸液濃度調(diào)至1.8×108CFU·mL-1，備用。

1.4 溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）的測定

采用二倍稀釋法，將連續(xù)倍比稀釋的溴化呋喃酮（每孔10μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的BHI液體培養(yǎng)基（每孔190μL）的聚乙烯96孔板。空白對照組為含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的BHI液體培養(yǎng)基（每孔200μL），陰性對照組為無水乙醇（每孔10μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的BHI液體培養(yǎng)基（每孔190μL）的聚乙烯96孔板。37℃厭氧培養(yǎng)48 h，肉眼觀察。同一濃度水平重復(fù)6次。

1.5 不同濃度的溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成量的影響

1.5.1 實驗分組和光密度值的測定 空白對照組為牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔200μL）。陰性對照組為無水乙醇（每孔10μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔190μL）的聚乙烯96孔板。實驗組為將1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC溴化呋喃酮（每孔10μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔190μL）的聚乙烯96孔板。一式3份，同一濃度水平重復(fù)4次。37℃厭氧培養(yǎng)48 h。微量移液器吸出孔內(nèi)菌懸液，PBS液輕輕洗孔3次以去除浮游細菌，加入新鮮BHI液體培養(yǎng)基（每孔200μL），充分混勻，使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，測量波長為600 nm下的光密度值，以反映生物膜的形成量。

1.5.2 掃描電鏡觀察不同濃度的溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響 采用聚乙烯12孔板，每孔內(nèi)放置一個無菌圓形玻片?？瞻讓φ战M為牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔1 000μL）。陰性對照組為無水乙醇（每孔50μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔950μL）的聚乙烯12孔板。實驗組為將1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC溴化呋喃酮（每孔50μL）加入含牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌懸液（每孔950μL）的聚乙烯12孔板。一式3份，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。微量移液器吸出孔內(nèi)菌懸液，PBS液輕輕洗孔3次以去除浮游細菌，用2.5%戊二醛24 h浸泡樣本固定，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇濃度梯度浸泡脫水，每次15min，脫水后放入醋酸異戊酯液浸泡15min置換，二氧化碳（CO2）臨界干燥，離子濺射表面固定鍍膜至材料表面成金黃色，SEM觀察分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。本實驗所得數(shù)據(jù)用±s表示。多組間采用單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05；兩兩比較采用Bofferoni法進行分析，其檢驗水準為α’=0.003。

2 結(jié)果

2.1 溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌最低抑菌濃度的測量結(jié)果

溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌MIC為9.00mg·L-1。

2.2 溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響

各組A600nm值的測量結(jié)果見表1。實驗組與空白對照組相比，實驗組A600nm值較空白對照組??；實驗各組隨著溴化呋喃酮濃度的增加，A600nm值呈現(xiàn)減小趨勢，即牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的量隨之減少，說明溴化呋喃酮抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成。

表1 不同濃度溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響Tab 1 Influence of the amount of Porphyromonas gingivalis biofilm upon different concentrations of brom inated furanone

單因素方差分析結(jié)果顯示：6組間A600nm值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Bofferoni法進行兩兩比較，結(jié)果顯示：空白對照組、陰性對照組、1/4MIC組與其之外的5組進行兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。1/4MIC組A600nm值較空白對照組和陰性對照組小，即牙齦卟啉單胞菌生物膜量減少，說明1/4MIC（2.25mg·L-1）溴化呋喃酮可以抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成。而1/2MIC、MIC、2MIC組分別與空白對照組、陰性對照組、1/4MIC組進行兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。說明1/2MIC（4.50mg·L-1）、MIC（9.00mg·L-1）、2MIC（18.00mg·L-1）均可抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成。1/2MIC、MIC、2MIC組間進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明1/2MIC（4.50mg·L-1）、MIC（9.00mg·L-1）、2MIC（18.00mg·L-1）溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 掃描電鏡觀察牙齦卟啉單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下牙齦卟啉單胞菌生物膜的觀察結(jié)果見圖1。厭氧培養(yǎng)48 h，空白對照組牙齦卟啉單胞菌形成完整、致密的生物膜結(jié)構(gòu)；陰性對照組較空白對照組的生物膜疏松；實驗組隨著溴化呋喃酮濃度的增加（1/4MIC組、1/2MIC組、MIC組），形成的生物膜結(jié)構(gòu)愈加疏松；2MIC組僅見散在的牙齦卟啉單胞菌菌體，未見生物膜結(jié)構(gòu)形成。

3 討論

溴化呋喃酮是目前研究較多的一類群體感應(yīng)抑制劑[7-10]，本研究測定了溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌的MIC，以便采用低于MIC的適宜溴化呋喃酮藥物濃度研究該化合物對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響，期望在不干擾牙齦卟啉單胞菌生長的前提下，通過對生物膜群體感應(yīng)系統(tǒng)途徑改變細菌生物膜的結(jié)構(gòu)，為尋找新型抗菌藥提供實驗依據(jù)。

本研究溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成影響的研究結(jié)果顯示：與空白對照組相比，1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成均有抑制作用。說明當(dāng)溴化呋喃酮濃度達到1/4MIC（2.25mg·L-1）時即可對牙齦卟啉單胞菌生物膜形成顯現(xiàn)出抑制作用。1/4MIC與1/2MIC比較，1/2MIC的抑制作用大于1/4MIC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明1/2MIC抑制生物膜形成的作用更明顯。1/2MIC、MIC、2MIC組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明1/2MIC（4.50mg·L-1）溴化呋喃酮即可獲得良好的抑制生物膜形成的效果。總之，牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響因素包括溴化呋喃酮及其溶劑，其中溴化呋喃酮起主要作用。隨著溴化呋喃酮藥物濃度升高，抑制作用越明顯。當(dāng)溴化呋喃酮藥物達到一定濃度（4.50mg·L-1）時，繼續(xù)加大溴化呋喃酮藥物濃度，抑制作用無明顯變化。該結(jié)果與Janssens等[11]的研究結(jié)果一致。本研究中溴化呋喃酮對牙齦卟啉單胞菌的MIC為9.00mg·L-1，明顯低于127mg·L-1，這可能與實驗菌種不同有關(guān)。Hentzer等[12]研究顯示：溴化呋喃酮（5mg·L-1）處理的綠膿桿菌組與溴化呋喃酮未處理的綠膿桿菌組比較，生物膜厚度明顯變薄。Vestby等[13]研究表明：溴化呋喃酮可明顯降低多種腸道沙門氏菌生物膜的形成。以上研究均與本研究中溴化呋喃酮抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的研究結(jié)果基本一致。

本研究中掃描電鏡觀察顯示：溴化呋喃酮不僅抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜量的生成，而且使牙齦卟啉單胞菌形成的生物膜結(jié)構(gòu)疏松。隨著溴化呋喃酮濃度增加，牙齦卟啉單胞菌生物膜的疏松程度增加。這與葉聯(lián)華等[14]的研究結(jié)果基本一致。

總之，溴化呋喃酮作為群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑，抑制了牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成，并使生物膜結(jié)構(gòu)稀疏。但溴化呋喃酮通過改變?nèi)后w感應(yīng)系統(tǒng)來抑制生物膜形成的具體機制有待進一步研究。溴化呋喃酮通過信號調(diào)節(jié)抑制細菌生物膜形成，但是不影響細菌的存活，不會導(dǎo)致抗生素使用時耐藥菌株產(chǎn)生，所以可能成為一種較理想的抗菌藥物，目前已經(jīng)有學(xué)者將其作為藥物開發(fā)的新靶點[8，15]。

[1]Fuqua WC,Winans SC,Greenberg EP.Quorum sensing in bacteria：The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators[J].J Bacteriol,1994,176（2）：269-275.

[2]Waters CM,Bassler BL.Quorum sensing：Cell-to-cell communication in bacteria[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2005,21：319-346.

[3]Kleerebezem M,Quadri LE,Kuipers OP,et al.Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria[J].Mol Microbiol,1997,24（5）：895-904.

[4]McNab R,Lamont RJ.Microbial dinner-party conversations：The role of LuxS in interspecies communication[J].J Med Microbiol,2003,52（Pt 7）：541-545.

[5]Lyon GJ,Muir TW.Chemical signaling among bacteria and its inhibition[J].Chem Biol,2003,10（11）：1007-1021.

[6]Frias J,Olle E,Alsina M.Periodontal pathogens produce quorum sensing signalmolecules[J].Infect Immun,2001,69（5）：3431-3434.

[7]Martinelli D,Grossmann G,Séquin U,et al.Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum[J].BMC Microbiol,2004,4（25）：25-35.

[8]Hentzer M,Wu H,Andersen JB,et al.Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors[J].EMBO J,2003,22（15）：3803-3815.

[9]Wu H,Song Z,Hentzer M,et al.Synthetic furanones inhibit quorum-sensing and enhance bacterial clearance in Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice[J].J Antimicrob Chemother,2004,53（6）：1054-1061.

[10]Defoirdt T,Crab R,Wood TK,et al.Quorum sensing-disrupting brominated furanones protect the gnotobiotic brine shrimp Artemia franciscana from pathogenic Vibrio harveyi,Vibrio campbellii,and Vibrio parahaemolyticus isolates[J].Appl Environ Microbiol,2006,72（9）：6419-6423.

[11]Janssens JC,Steenackers H,Robijns S,et al.Brominated furanones inhibit biofilm formation by Salmonella enterica serovar typhimurium[J].Appl Environ Microbiol,2008,74（21）：6639-6648.

[12]Hentzer M,Riedel K,Rasmussen TB,et al.Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound[J].Microbiology,2002,148（Pt 1）：87-102.

[13]Vestby LK,L?nn-Stensrud J,M?retr?T,et al.A synthetic furanone potentiates the effect of disinfectants on Salmonella in biofilm[J].J Appl Microbiol,2010,108（3）：771-778.

[14]葉聯(lián)華,許賡,黃云超,等.溴代呋喃酮對聚氯乙烯材料表面大腸桿菌生物膜形成的影響[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2010,24（7）：871-874.Ye Lianhua,Xu Geng,Huang Yunchao,et al.Effect of brominated furanones on biofilm formation of Escherichia coli on polyvinyl chloride material[J].Chin J Reparative Reconstructive Surgery,2010,24（7）：871-874.

[15]M?ker N,Dean CR,Tao J.Pseudomonas aeruginosa increases formation ofmultidrug-tolerant persister cells in response to quorumsensing signaling molecules[J].J Bacteriol,2010,192（7）：1946-1955.