經(jīng)前三劑止痛方治療痛經(jīng)活性部位的篩選*

孫緒美，姜國云，賴曉藝，范同梅，方 玲

300251天津市河西區(qū)婦產(chǎn)科醫(yī)院（范同梅）

痛經(jīng)是婦女常見病，發(fā)病率高且嚴(yán)重影響婦女健康和工作效率。痛經(jīng)的發(fā)病原因較復(fù)雜，其發(fā)病機制還不完全清楚。研究表明，其形成主要涉及以下因素：與月經(jīng)的周期性生理變化相關(guān)，痛經(jīng)多發(fā)生在黃體期和月經(jīng)初期，說明此期機體內(nèi)環(huán)境的改變是痛經(jīng)形成基礎(chǔ)；與子宮內(nèi)膜、子宮平滑肌細(xì)胞和子宮壁螺旋動脈等病理改變相關(guān)；與內(nèi)分泌因素改變相關(guān)，在痛經(jīng)形成過程中，前列腺素、血管加壓素、催產(chǎn)素、雌激素、孕激素、內(nèi)皮素、一氧化氮、β-內(nèi)啡肽、鈣（Ca2＋）和氧自由基等的合成和分泌發(fā)生改變，它們與不同的靶點結(jié)合，通過不同的途徑，促使痛經(jīng)形成。其中前列腺素在痛經(jīng)形成中起重要作用，而血管加壓素、催產(chǎn)素、雌激素和孕激素可通過促進前列腺素的合成和分泌，形成痛經(jīng)。內(nèi)皮素、一氧化氮和β-內(nèi)啡肽等受雌激素和血管損傷的影響，進一步加重血管損傷和疼痛癥狀。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和組織中氧自由基的生成也受血管損傷的影響，其又進一步加重血管的損傷，由此構(gòu)成了復(fù)雜的痛經(jīng)損傷發(fā)生機制。

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上[1-3]，對經(jīng)前三劑止痛方（JQF）進行分離提取，獲得了4個提取部位，即JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-W、JQF-A-W-W 并采用小鼠痛經(jīng)模型扭體實驗，二甲苯致炎實驗，熱刺激實驗和大鼠離體子宮平滑肌收縮實驗對它們進行了活性篩選，進而在整體痛經(jīng)模型和離體子宮平滑肌模型上對篩選獲得活性部位治療痛經(jīng)的作用及其可能的作用機制進行了實驗研究。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑、實驗動物和器材 JQF和JQF-AE、JQF-A-N-30、JQF-W、JQF-A-W-W 由天津中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)實驗室制備。JQF（當(dāng)歸、川芎、赤芍、益母草、桂枝、蒲黃、五靈脂、白術(shù)、茯苓）,購自天津中醫(yī)藥大學(xué)?？滇t(yī)院，并經(jīng)生藥學(xué)鑒定。

前列腺素 F2α（PGF2α），Sigma公司；乙酰膽堿（Ach）（批號060517），北京化學(xué)試劑公司；縮宮素注射液（10 U，1 mL，批號 040912），上海第一生化藥業(yè)有限公司；己烯雌酚注射液（0.5 mg，1 mL，批號0806021），天津金耀氨基酸有限公司。阿司匹林腸溶片（25 m/片，批號：20070501），印尼拜耳公司制造；二甲苯、生理鹽水，中國大冢制藥有限公司；臺式液[NaCl 8.0g、10%KCl2.0 mL（0.2g）、10%MgSO4·7H2O 2.6 mL （0.26g）、5%NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065g）、NaHCO31.0g、1 mol/L CaCl21.8 mL（0.2g）、葡萄糖1.0g，蒸餾水加至1 000 mL]。

雌性KM小鼠22～26g，雌性SD大鼠，240～280g，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)動物房[合格證號：SCXK（京）2007-0001]；RM6240B/C生物信號采集理系統(tǒng)2.0j版，肌肉張力換能器（JZ101型，0～5g），恒溫槽（WC/09-05），麥?zhǔn)显〔?，光測痛儀，打孔器。

1.2 JQF有效部位提取[4]

1.2.1 JQF的制備 按配方取各味生藥，粉碎后用5倍95%乙醇加熱回流提取2次，過濾后合并95%乙醇提取液，將乙醇提取液濃縮至無醇味；藥渣中加入5倍體積的水，加熱回流提取2次過濾，將95%乙醇提取液與水提液合并，濃縮至1 kg（生藥）/L，出膏率為24.75%

1.2.2 JQF-A-N-30的制備 上述配方取各味生藥，粉碎后用水煎煮3次，每次2 h。濾液合并后濃縮并進行大孔樹脂柱層析分離，依次以水、30%乙醇洗脫，30%乙醇洗脫部位經(jīng)濃縮，冷凍干燥，出膏率為1.98%。

1.2.3 JQF-A-E的制備 按上述配方取各味生藥，粉碎后用95%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過濾后合并95%乙醇提取液，將乙醇提取液濃縮至無醇味，得乙醇提物JQF-A。將此醇提物經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮，出膏率為2.77%。

1.2.4 JQF-A-W-W的制備 按上述配方取各味生藥，粉碎后用95%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h過濾后合并95%乙醇提取液，將乙醇提取液濃縮至無醇味，得乙醇提物JQF-A。該醇提物經(jīng)乙酸乙酯和正丁醇萃取后的水相部位經(jīng)大孔吸附樹脂分離，以水、30%乙醇洗脫，水洗脫部位經(jīng)濃縮，冷凍干燥，出膏率為5.42%。

1.2.5 JQF-W制備 按上述配方取各味生藥，粉碎后用95%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過濾。藥渣用水加熱回流提取2次，每次2 h，將水提液過濾、適當(dāng)濃縮，冷凍干燥為JQF-W，出膏率為6.07%。

1.3 小鼠鎮(zhèn)痛實驗

1.3.1 JQF提取物對熱刺激致小鼠疼痛實驗的影響 取雌性KM小鼠70只，使用智能熱板儀重復(fù)測定小鼠正常痛閾值2次，選取基礎(chǔ)痛閾在5～10秒之間的小鼠，取2次痛閾平均值作為該鼠給藥前的基礎(chǔ)痛閾值。按照隨機數(shù)字表法將動物分為正常對照組、阿司匹林組，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-W-W、JQF-W組，每組10只，每天灌胃給藥（0.02 mL/g），連續(xù) 3 d，對照組給予等容積蒸餾水。于末次給藥后30、60、120 min分別測小鼠痛閾值計算痛閾提高百分率，比較組間差異。如60秒仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60秒計算。

痛閾提高百分率=（藥后痛閾-基礎(chǔ)痛閾）/基礎(chǔ)痛閾×100%

1.3.2 小鼠痛經(jīng)模型扭體實驗 取雌性KM小鼠，18～22g，70只每日皮下注射己烯雌酚每只0.2 mg，連續(xù)3 d第4天實驗前禁食不禁水12～16 h，實驗時按體質(zhì)量隨機分正常對照組、阿司匹林組、JQF、JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-A-W-W、JQF-W 組，灌胃給相應(yīng)藥物（0.02 mL/g），正常組、模型組給等體積的生理鹽水，給藥40 min后腹腔注射（2×103U/L）催產(chǎn)素生理鹽水溶液0.01 mL/g，注射縮宮素5 min后用錄像機拍攝記錄扭體次數(shù)，連續(xù)拍攝30 min，計算該時間段內(nèi)扭體次數(shù)。

1.4 小鼠抗炎實驗 取KM小鼠70只，雌性，體質(zhì)量18～22g，隨機分為正常對照組、阿司匹林組、JQF、JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-A-W-W、JQF-W組，每組10只。灌胃給藥（0.02 mL/g），每天l次，連續(xù)3 d，空白對照組給予等容積蒸餾水。末次給藥1 h后將二甲苯100 μL均勻滴于小鼠右耳兩面，左耳不涂作為對照。60 min后將小鼠脫頸椎處死，用直徑8 mm打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，秤質(zhì)量，以左、右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度，比較各組間差異。

1.5 大鼠離體子宮平滑肌實驗 取雌性SD大鼠體質(zhì)量180～220g，皮下注射己烯雌酚2 mg/kg，以增加子宮平滑肌條對藥物的敏感性。24 h后將大鼠頸脫臼處死，迅速剖取子宮，兩個子宮角各取2 cm的子宮段，將其懸掛于充滿臺氏液的麥?zhǔn)显〔壑?，一端固定在浴?nèi)T形鉤上，一端與肌肉張力換能器連接，恒溫37℃、飽和氧氣孵育，肌肉張力換能器通過計算機軟件RM6240B/C生物信號采集理系統(tǒng)2.0j版，記錄肌條的收縮情況[5]。

待子宮收縮穩(wěn)定后，先記錄5～10 min正常收縮曲線，隨后加入臺氏液中，分別給藥，縮宮素（終濃度10 U/L）、ACh（終濃度10 μmol/L）、PGF2α（終濃度 1 mg/L）、KCL（終濃度 60 mmol/L）刺激子宮收縮10 min后，再分別加入受試藥物加入JQF（終濃度10 000 mg/L）、JQF-A-N-30（終濃度 160 mg/L）JQFA-E（終濃度 200 mg/L）、JQF-A-W-W（終濃度 200、400、600 mg/L）、JQF-W（終濃度 240、480、960 mg/L）阿司匹林（終濃度16 mg/L），記錄給藥后子宮收縮頻率，幅度，觀察藥物對子宮痙攣性收縮的對抗作用，記錄20 min，用營養(yǎng)液沖洗3次后，進行下一次實驗觀察。用RM6240C型多道生理信號采集處理系統(tǒng)采集處理數(shù)據(jù)，并求出子宮收縮曲線下面積（AUC）。

1.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 18.0軟件包分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布的計量資料組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布的計量資料組間比較采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 對熱刺激小鼠疼痛的影響 結(jié)果提示，藥后30 min，阿司匹林組小鼠痛閾提高百分率與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；藥后 60 min，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E和阿司匹林組小鼠痛閾提高百分率與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），JQF-A-W-W組小鼠痛閾提高百分率亦具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；藥后 120 min，JQF、JQF－A－N－30、JQF－A－E和阿司匹林組痛閾提高百分率，與正常對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），JQF－A－W－W 動物痛閾提高百分率亦具有差異（P＜0.05）。見表1。

表1 對熱刺激小鼠疼痛的影響（±s，n＝10）

表1 對熱刺激小鼠疼痛的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

120 min痛閾提高百分率（%）正常對照組 - 18.87± 7.44 17.47±6.81 18.42± 5.79 JQF 100 19.78±14.80 35.18±6.71** 54.85±19.54**JQF-A-N-30 8 18.56±17.54 28.23±8.43** 35.67±14.29**JQF-A-E 20 14.55±18.29 25.94±5.43** 30.45±26.62**JQF-A-W-W 40 15.56±16.00 23.37±5.09* 24.66±13.71*JQF-W 24 17.56±16.00 18.37±8.09 20.26±13.71*阿司匹林組 20 28.91±17.33** 45.84±9.60** 47.52±19.54**組別 劑量（mg/20g）30 min痛閾提高百分率（%）60 min痛閾提高百分率（%）

2.2 對小鼠痛經(jīng)模型扭體實驗的影響 結(jié)果提示，所有的分組與正常組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異說明小鼠痛經(jīng)模型造模成功，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、和阿司匹林組對縮宮素所致小鼠扭體反應(yīng)具有顯著的抑制作用，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），JQF-A-W-W 與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），JQF-W對小鼠痛經(jīng)模型扭體沒有抑制作用。

2.3 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 結(jié)果提示，與正常組比較，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、和阿司匹林組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹有顯著的抑制作用（P＜0.01），JQF-A-W-W、JQF-W 與正常組比較沒有抑制作用。見表3。

表2 對痛經(jīng)模型小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n＝10）

表2 對痛經(jīng)模型小鼠扭體次數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01；與正常組比較，##P<0.01。

組別 劑量（mg/只） 扭體次數(shù)（次）模型組 - 33.9±8.78##阿司匹林 20 5.2±2.81##**JQF 100 8.4±5.52##**JQF-A-N-30 8 12.8±5.72##**JQF-A-E 20 13.9±8.74##**JQF-A-W-W 40 26.9±3.24##*JQF-W 24 29.7±3.24##正常組 - 0.0±0.00**

表3 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n＝10）

表3 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（±s，n＝10）

注：與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

組別 劑量（mg/只） 腫脹度（mg）正常組對照組 - 16.78±1.81 JQF 100 8.01±1.42**JQF-A-N-30 8 9.13±1.37**JQF-A-E 20 9.82±1.62**JQF-A-W-W 40 16.29±1.78 JQF-W 24 16.36±1.38阿司匹林組 20 8.13±1.35**

2.4 對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響

2.4.1 對子宮收縮促進劑（縮宮素、前列腺素F2α、乙酰膽堿）誘發(fā)子宮痙攣性收縮的影響 結(jié)果提示，在給藥前，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-WW、JQF-W、吐溫-80、阿司匹林組與臺氏液對照中的離體子宮標(biāo)本無差異。加入子宮激動劑縮宮素、PGF2α、Ach 后，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、阿司匹林對子宮痙攣性收縮與加藥前有明顯的抑制性作用，JQF-A-W-W、JQF-W作用不明顯，累計加藥有抑制子宮平滑肌收縮的趨勢但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，吐溫-80作為助溶劑對大鼠離體子宮平滑肌收縮并沒有抑制作用。見表4-5。

2.4.2 對KCL強直刺激的大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 結(jié)果提示，在給藥前，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-W-W、JQF-W、吐溫-80、阿司匹林組與臺氏液對照中的離體子宮標(biāo)本無差異。加入KCL致子宮平滑肌強直收縮，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、阿司匹林與加藥前子宮平滑肌持續(xù)收縮有明顯的抑制性作用，JQF-A-W-W、JQF-W作用不明顯，累計加藥有抑制子宮平滑肌收縮的趨勢但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義，吐溫-80作為助溶劑對大鼠離體子宮平滑肌收縮并沒有抑制作用。

表4 對子宮激動劑刺激大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表4 對子宮激動劑刺激大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：分別與任氏液對照組比，**P<0.01。

子宮收縮曲線下面積（mV·s）濃度（g/L） 給藥前 縮宮素 PGF2α Ach臺式液對照組 - 0.294 2±0.053 6 1.826 9±0.276 0 1.979 4±0.371 7 1.295 2±0.052 6 JQF 10 0.306 8±0.019 5 0.534 8±0.017 2** 0.988 2±0.100 4** 0.313 2±0.035 1**JQF-A-N-30 0.16 0.314 7±0.024 7 0.985 7±0.034 0** 0.683 2±0.056 3** 0.852 2±0.035 7**JQF-A-E 0.20 0.269 3±0.008 4 0.852 9±0.035 4** 0.321 5±0.006 9** 0.895 4±0.020 5**JQF-A-W-W 0.20 0.324 4±0.021 9 1.625 8±0.002 1 1.588 1±0.021 1 1.204 4±0.005 1 0.40 1.589 4±0.004 6 1.509 1±0.115 7 1.201 5±0.027 6 0.80 1.524 1±0.005 8 1.439 0±0.007 1 1.183 7±0.079 2 JQF-W 0.24 0.279 8±0.010 5 1.768 5±0.047 1 1.672 1±0.125 1 1.227 3±0.103 5 0.48 1.459 4±0.016 2 1.562 1±0.100 9 1.198 7±0.025 1 0.96 1.432 6±0.017 9 1.354 2±0.047 3 0.987 7±0.048 6組別 給藥后阿司匹林組 0.016 0.336 4±0.040 4 0.323 7±0.039 2** 0.581 9±0.102 8** 0.675 6±0.054 5**吐溫-80（mL） 20 0.332 9±0.010 8** 1.791 9±0.010 9 1.884 1±0.067 3 1.225 7±0.025 5

表5 對KCL刺激大鼠離體子宮持續(xù)收縮模型的影響

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，JQF對經(jīng)重酒石酸去甲腎上腺素，甲磺酸倍他司汀，米非司酮處理的離體子宮均具有緩解痙攣的作用[6]。這種解痙作用一方面與臨床研究的結(jié)果一致，另一方面對其作用機制也有一定的提示作用。目前對JQF中的某些單味藥或復(fù)方在解痙過程中的作用有文獻研究，如當(dāng)歸精油（含藁本內(nèi)酯>97%）無論對正常未孕離體子宮還是對縮宮素、PGF2α等處理的離體子宮，都具有緩解痙攣的作用[7]；當(dāng)歸水提液對縮宮素引起的離體小鼠子宮的收縮頻率和收縮幅度均有顯著抑制作用，芍藥水提液則對收縮頻率的抑制作用較明顯，其中芍藥與當(dāng)歸的配伍對收縮頻率的抑制作用更強[8]；復(fù)方芎歸散（當(dāng)歸、川芎兩味藥組成）總提取物可使大鼠在體子宮平滑肌的收縮力和活動度減少[9]。JQF是臨床經(jīng)驗方。其組成：當(dāng)歸、川芎、赤芍、益母草、桂枝等。JQF重用當(dāng)歸補血，補其不足；臣以川芎、益母草行血，行其有余；佐以赤芍涼血，防其動血；使以桂枝溫通，緩其拘急。全方攻補兼施，溫通補泄并用，力效專攻，共同起到調(diào)氣和血止痛的效果。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，前列腺素幾乎存在于全身各種重要組織和體液之中，在女性生殖系統(tǒng)如子宮內(nèi)膜、月經(jīng)血及卵巢中均有分布，痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜及經(jīng)血中前列腺素較正常婦女顯著偏高[10]，體內(nèi)過高PGF2α是原發(fā)性痛經(jīng)的主要發(fā)病原因，同時前列腺素是人體內(nèi)與炎癥反應(yīng)有關(guān)的物質(zhì)；縮宮素不僅直接作用于子宮平滑肌引起子宮收縮，而且同時刺激子宮內(nèi)膜釋放前列腺素，兩者協(xié)同作用引起子宮收縮，原發(fā)性痛經(jīng)患者體內(nèi)過高的縮宮素可能是導(dǎo)致痛經(jīng)的原因之一[11]；ACh作用于子宮平滑肌細(xì)胞可以引起子宮平滑肌劇烈收縮。本研究結(jié)果表明，JQF-A-N-30、JQF-A-E 可以顯著抑制 PGF2α、縮宮素和ACh引起的子宮平滑肌條劇烈收縮，尤其對收縮頻率加快的抑制作用較強，同時具有抗炎作用。縮宮素、PGF2α、ACh均可作用于平滑肌細(xì)胞上各自的受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（Ca2+）升高，而細(xì)胞Ca2+增加可能是引起子宮平滑肌收縮的直接原因。細(xì)胞Ca2+增加有細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放兩種途徑。KCl可引起細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致電壓依賴性鈣通道開放,細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，最終引起細(xì)胞Ca2+升高，因此可建立KCl致子宮平滑肌強直收縮的模型來考察藥物對細(xì)胞外鈣內(nèi)流所致平滑肌收縮的影響。JQF還可通過其抗炎作用，抑制原發(fā)性痛經(jīng)的形成[12]。

綜合整體小鼠抗炎鎮(zhèn)痛實驗和離體子宮平滑肌實驗的篩選結(jié)果，JQF-A-N-30和JQF-A-E具有抗炎鎮(zhèn)痛作用的同時對離體子宮平滑肌的收縮亦具有直接抑制作用，提示它們可能是JQF治療痛經(jīng)的兩個活性部位。為此本研究在后續(xù)的實驗中對它們治療痛經(jīng)的作用及其可能的機制進行進一步研究。

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