蠟梅AFLP反應體系優(yōu)化及引物篩選

趙明曉，馮志敏，胡 湛，趙振利，范國強

(1.河南農業(yè)大學，河南 鄭州 450002;2.信陽農業(yè)高等?？茖W校，河南 信陽 464000;3.焦作市園林局，河南 焦作 454003)

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是一種DNA多態(tài)性分子標記技術.既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性［1］.目前，在梅花、泡桐、蘋果、白樺和板栗等［2～7］木本植物親緣關系研究及遺傳多樣性［8］、圖譜構建［9～11］、基因定位［12］、品種鑒定［13，14］、雜種優(yōu)勢預測和分子標記輔助選擇育種［15］等方面得到廣泛應用.蠟梅(Chimonanthus praecox)為中國特有的花卉植物，品種多，具有較高的觀賞價值.近年來，研究人員對蠟梅SRAP［16］，RAPD［17］，ISSR［18］和 SSR［19］等技術體系進行了深入研究，在其AFLP技術體系方面雖然也有文獻報道［20～22］，但存在體系不完善等問題，并且在目前所建立的體系中都沒有進行引物篩選工作，給蠟梅分子生物學研究帶來了很多困難.為深入開展蠟梅分子輔助育種和基因組等研究奠定基礎，作者進行了蠟梅AFLP技術體系優(yōu)化及引物篩選工作.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為河南農業(yè)大學校區(qū)中心花壇栽植4 a的素心蠟梅(Chimonanthus praecox)健康植株當年生枝條葉片.

1.2 試驗方法

1.2.1 蠟梅基因組DNA提取 蠟梅基因組DNA的提取參照張延召等［23］的方法，利用紫外分光光度計和質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量.

1.2.2 蠟梅AFLP體系優(yōu)化

1.2.2.1 酶切體系 參照曹喜兵等［24］的方法.總體積為 20 μL，包括 600 ng 模板 DNA，0.2 μL 100 × BSA，3 U Pst I，3 U Mse I和2.0 μL 10 × NEB Buffer，加超純水至20 μL.混勻后在PCR儀上37℃分別酶切 1，2，3，4，5，6 h 后，80 ℃失活20 min.然后，分別取其產(chǎn)物5 μL在質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠上電泳(4～5 V·cm－1).根據(jù)電泳結果篩選出最佳酶切時間.

1.2.2.2 連接體系 接頭(由北京奧科生物技術有限責任公司合成)的制備:Pst I接頭(10 μmol·L－1):分 別 吸 取 2 μL 的 Pst I 正 (5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’)、反 (5’-TGTACGCAGTCTAC-3’)接頭，然后加入36 μL的雙蒸水混合至 40 μL;Mse I接頭(100 μmol·L－1):分別吸取20 μL 的 Mse I正(5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)、反(5’-TACTCAGGACTCAT-3’)接頭，然后混勻.最后把接頭放在離心機上點離拿出放入4℃冰箱20 min后，放入PCR儀上60℃制接頭.連接體系總體系20 μL，該體系包括15 μL上述酶切產(chǎn)物，0.25 μmol·L－1Pst I 接頭，2.5 μmol·L－1Mse I接頭，不同量(1.0，2.0，3.0，4.0 U)的 T4連接酶及 1 μL 10 × T4Buffer，加去離子水至 20 μL，然后于PCR擴增儀上在22℃條件下分別連接8，10，12，14，16，18 h，根據(jù)連接結果篩選出最佳連接時間.

1.2.2.3 預擴增體系 (1)連接產(chǎn)物用量優(yōu)化.在各體系中分別加入 5 μL 稀釋為 1，5，10，15，20，25 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后分別用去離子水補至 20 μL.(2)Mg2+用量優(yōu)化.在各體系中分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀釋10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和300 μmol·L－1dNTP，分別用去離子水補至20 μL.(3)Taq酶用量優(yōu)化.在各體系中分別加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 U 的 Taq 酶，5 μL 稀釋 10 倍連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后用去離子水補至20 μL.(4)dNTP濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀釋10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00和2U Taq酶，然后分別用去離子水補至20 μL.(5)引物濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1預擴增引物 P00 和M00，稀釋 10 倍連接產(chǎn)物 5μL，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，用去離子水補至 20 μL.

1.2.2.4 選擇性擴增體系 (1)預擴增產(chǎn)物用量優(yōu)化.在各體系中分別加入 5 μL稀釋5，10，15，20，25，30 倍的預擴增產(chǎn)物，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I引物，2.0 mmol·L－1的Mg2+，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq 酶，加去離子水補至20 μL以進行選擴.(2)Mg2+用量優(yōu)化.在各體系中分別加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀釋 10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I 引物和 300 μmol·L－1dNTP，分別用去離子水補至 20 μL.(3)Taq 酶濃度優(yōu)化.不同體系中分別加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U Taq 酶，5 μL 稀釋 20 倍預擴增產(chǎn)物，0.5μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水至20 μL.(4)dNTP濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀釋 20 倍的預擴增產(chǎn)物，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，2 U Taq 酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水至 20 μL.(5)引物濃度優(yōu)化.在不同的體系中分別加入 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物及 5 μL 稀釋20 倍預擴增產(chǎn)物，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水補至20 μL.

1.2.3 引物篩選 利用優(yōu)化后的蠟梅 AFLP體系，對64對引物(由奧科生物科技有限公司合成)組合進行篩選，篩選出適合蠟梅AFLP的選擇性擴增引物.擴增程序、PCR選擴產(chǎn)物電泳、染色及凝膠掃描參照曹喜兵等［24］的方法，每泳道上樣量為5 μL擴增產(chǎn)物.電泳結束后，選擇譜帶清晰和數(shù)目較多的引物作為AFLP反應的最佳引物.

2 結果與分析

2.1 蠟梅基因組DNA的質量

利用紫外分光光度計測定提取的蠟梅基因組DNA 的結果為:A230=0.078;A260=0.314;A280=0.174.A260/280，A260/230，A230/280的值分別為 1.805，4.026，0.448.說明提取的 DNA 無蛋白質、RNA 和酚類等小分子物質的污染.由DNA瓊脂糖凝膠電泳結果表明(圖1)，DNA片段達到5 000 bp以上，完全能滿足AFLP分析要求.

圖1 不同DNA量的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Electrophoresis validation of different concentrations genome DNA

2.2 蠟梅AFLP體系優(yōu)化

2.2.1 酶切反應體系優(yōu)化 為了得到更好的選擴結果，選擇600 ng蠟梅進行不同時間酶切處理，其瓊脂糖凝膠電泳結果表明(圖2)，經(jīng) 1，2，3，4，5，6 h酶切后，模板DNA皆能被完全切開，并且酶切片段幾乎沒差別，為保證蠟梅AFLP的后續(xù)試驗結果，本試驗選擇2 h為該體系最佳的酶切時間.

圖2 不同時間酶切DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA with different enzyme cut times

2.2.2 連接反應體系優(yōu)化 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果表明(圖3)，在反應體系中加入3.0 U的T4連接酶，0.25 μmol·L－1Pst I 和 2.5 μmol·L－1Mse I接頭有利于蠟梅AFLP連接效果.在連接時間分別為8，10，12，14，16，18 h 條件下，隨著連接時間的增加，預擴增產(chǎn)物量逐漸增加，為了試驗最佳效果，本體系選擇連接反應時間為12 h.

圖3 不同時間連接DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA with different connection times

2.2.3 預擴增反應體系優(yōu)化 不同連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)結果表明(圖4)，連接產(chǎn)物用量對預擴反應有較大影響.當連接產(chǎn)物分別稀釋1，5，10倍時，擴增片段大小幾乎相同;當連接產(chǎn)物稀釋超過10倍時，擴增產(chǎn)物量明顯降低，因此，本體系中蠟梅AFLP預擴增連接產(chǎn)物以稀釋10倍為宜.由不同Mg2+濃度對預擴增反應結果(圖5)可以看出，當Mg2+濃度為0.5 mmol·L－1時擴增出的產(chǎn)物量比較模糊，而 Mg2+濃度分別為 1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1時均能擴增清晰的譜帶;但 2.0 mmol·L－1時譜帶豐寓而且最清晰，擴增效果最好.因此，本試驗從擴增的結果和成本考慮，確定Mg2+的最優(yōu)濃度為2.0 mmol·L－1.從不同Taq酶量對預擴增反應結果表明(圖6).當Taq酶量為1.0 U時，擴增產(chǎn)物量較少，但當Taq酶量從1.5 U增加到2.5 U時，擴增產(chǎn)物明顯增多，并且隨著酶量的繼續(xù)增大，擴增產(chǎn)物增加幾乎相同.因此，選擇2.0 U作為蠟梅AFLP預擴增最佳Taq酶用量.由dNTP用量對預擴增反應可以看出(圖7)，當dNTP濃度為 100 μmol·L－1時，預擴增產(chǎn)物量較低，當 dNTP濃度大于200 μmol·L－1時，預擴增產(chǎn)物量先升高后降低.這是dNTP與Taq酶對Mg2+競爭的結果，當 dNTP 濃度為 300 μmol·L－1時，預擴增產(chǎn)物量最大.因此，本試驗選擇300 μmol·L－1作為蠟梅預擴增最適dNTP濃度.由引物濃度對預擴增產(chǎn)物影響可以看出(圖 8)，當其濃度為 0.3μmol·L－1時，預擴增產(chǎn)物量較低，當其濃度從 0.5μmol·L－1增加到1.1μmol·L－1時，擴增產(chǎn)物增加量幾乎相同.從試驗成本考慮，選擇 0.5 μmol·L－1為該體系的最佳引物濃度.

圖9 連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對選擴影響Fig.9 Effect of connection product diluted times on selective amplification

2.2.4 選擇性擴增反應體系優(yōu)化 不同預擴產(chǎn)物稀釋倍數(shù)結果表明(圖9)，預擴產(chǎn)物用量對選擇性擴增反應有較大影響.當預擴產(chǎn)物分別稀釋5，10，15，20倍時，擴增片段大小幾乎相同;當預擴產(chǎn)物稀釋超過20倍時，擴增產(chǎn)物量明顯降低，考慮到節(jié)省樣品，本體系中蠟梅AFLP選擇性擴增預擴產(chǎn)物選擇稀釋20倍.由不同Mg2+濃度對選擇性擴增反應結果可以看出(圖10)，當 Mg2+濃度為0.5 mmol·L－1時擴增出的產(chǎn)物比較模糊，但隨著Mg2+濃度的提高，擴增增出的產(chǎn)物量逐漸增加.因此，本試驗從擴增的結果和成本考慮，確定Mg2+的最優(yōu)濃度為2.0 mmol·L－1.不同Taq酶量對選擇性擴增反應影響較大(圖11).當Taq酶為0.5 U時，蠟梅AFLP擴增產(chǎn)物量較少，但當Taq酶增加到2 U時，擴增產(chǎn)物量明顯增加.因此，選擇2 U為Taq酶最適用量.dNTP濃度對于選擇性擴增也有較明顯的影響(圖12).當dNTP濃度低于200 μmol·L－1時，選擇性擴增產(chǎn)物量較低，當dNTP濃度大于200 μmol·L－1時，選擇性擴增產(chǎn)物量先升高后降低.這是由于dNTP與Taq酶對Mg2+競爭的結果.當 dNTP 濃度為 300 μmol·L－1時，選擴產(chǎn)物量最大.因此，300 μmol·L－1為蠟梅 AFLP 選擇性擴增體系中dNTP濃度的最適濃度.由不同引物濃度優(yōu)化試驗結果可以看出(圖13)，引物濃度對選擇性擴增反應有較大的影響.當引物濃度為0.3 μmol·L－1時，擴增量較少，隨著引物濃度增大，擴增產(chǎn)量逐漸增多，擴增產(chǎn)量趨于穩(wěn)定.因此，本體系中，選取引物適宜濃度為 0.5 μmol·L－1.

2.2.5 蠟梅AFLP選擇性擴增引物篩選 用上述方法優(yōu)化出的蠟梅體AFLP反應體系，對64對引物組合進行篩選，篩選出了96對引物(表1).結果表明(圖14)，擴增產(chǎn)物電泳譜帶清晰、分辨率高、重復性好、多態(tài)性強.因此，這些引物可用來開展蠟梅的分子生物學研究.

表1 蠟梅AFLP選擇性擴增引物Table 1 Primer for AFLP of the selective amplification

圖14 47對引物的AFLP選擇性擴增圖Fig.14 AFLP of selective amplification with 47 pairs of primers

3 結論與討論

本研究通過對蠟梅AFLP體系優(yōu)化，得出其最佳酶切體系(20 μL)為模板 DNA 600 ng，Pst I和Mse I各為3 U，在37℃下雙酶切2 h;在20 μL最佳連接體系中酶切產(chǎn)物為15 μL，3 U T4連接酶，0.25 μmol·L－1Pst I接頭，2.5 μmol·L－1Mse I接頭，1 μL 10 × T4buffer，在 22 ℃ 下連接 10 h;在20 μL最佳預擴反應體系中稀釋10倍的連接產(chǎn)5 μL，2.0 mmol·L－1Mg2+，2 U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I 和 Mse I引物 (P+AGA/M+ATC);在20 μL最佳選擇性擴增反應體系中5 μL 稀釋 20 倍的預擴增產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(P+AGA/M+ATC).此外，經(jīng)引物篩選試驗，從64對引物組合中，選出了96對引物可用于蠟梅 DNA的 AFLP分析.

蠟梅為木本植物，其葉片中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質，嚴重影響基因組DNA的得率和純度及下游工作的進行［21］.本研究針對蠟梅葉片富含單寧和多糖等物質，利用張延召等［23］的方法提取其基因組DNA，可有效去除這些物質.該方法提取的DNA純度高，片段大，用于AFLP反應中，能擴增出清晰的條帶，為蠟梅的分子標記分析提供了基礎.

［1］VOS P R，HOGERS M，BLEEKER M，et al.AFLP:A new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic Acids Research，1995，23(21):4407 －4414.

［2］明 軍.梅花DNA指紋圖譜的建立與研究［D］.北京:北京林業(yè)大學，2002.

［3］曹喜兵，何 佳，翟曉巧，等.泡桐AFLP反應體系建立及引物篩選［J］.河南農業(yè)大學學報，2010，44(2):145－150.

［4］SCOTT K D，ABLETT E M，LEE I S，et al.AFLP markers distinguishing an nutant of flame seedless grape［J］.Euphytica，2000，113:245－249.

［5］祝 軍，王 濤，趙玉軍，等.應用AFLP分子標記鑒定蘋果品種［J］.園藝學報，2000，27(2):102 －106.

［6］連 蓮，魏志剛，楊傳平，等.白樺AFLP體系的建立及優(yōu)化［J］.東北林業(yè)大學學報，2007，35(5):1－4.

［7］YAMAMO T，SHIMADA T，KOTOBUKI K，et al.Genetic characterization of Asian chestnut varieties assessed by AFLP［J］.Breeding Science，1998，48(4):359 －363.

［8］YUAN Z，YIN Y，QU J，et al.Population genetic diversity in Chinese pomegranate(Punica granalum L.)cultivars revealed by fluo-rescent-AFLP markers［J］.Genet Genomics，2007，34(12):1061 －1071.

［9］孫涌棟，李貞霞，張興國，等.黃瓜cDNA-AFLP分析體系的建立［J］.華北農學報，2007，22(4):116－119.

［10］蕭力爭.晏嫦好，李家賢，等.鳳凰單叢古茶樹資源的遺傳多樣性AFLP分析［J］.茶葉科學，2007，27(4):280－285.

［11］李艷梅，段會軍，馬峙英.西瓜種質資源的遺傳多樣性及親緣關系的AFLP分析［J］.華北農學報，2007，22(增刊):177－180.

［12］PERCIFIELD R J，HAWKINS J S，MCCOY J A，et al.Genetic diversity in hypericum and AFLP markers for species-specific identification of H.perforatum L.［J］.Planta Med，2007，73(15):1614 －1621.

［13］黃玉輝，陳 濤，吳曉偉，等.甘蔗突變體AFLP分析［J］.西南農業(yè)學報，2007，20(4):727－731.

［14］侯慧敏，廖伯壽，雷 永，等.花生銹病抗性的AFLP標記［J］.中國油料作物學報，2007，29(2):89 －92.

［15］吳敏生，王守才，戴景瑞.AFLP分子標記在玉米優(yōu)良自交系優(yōu)勢群劃分中的應用［J］.作物學報，2000，26(1):9－13.

［16］左丹丹，趙海濤，劉 春，等.蠟梅天然群體遺傳多樣性的SRAP標記分析［J］.園藝學報，2009，36(8):1197－1202.

［17］盧建國，杜靈娟.蠟梅品種的RAPD分析［J］.南京林業(yè)大學學報:自然科學版，2007，31(5):109 －112.

［18］趙 冰，張啟翔.蠟梅種質資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］.植物研究，2008，28(3):315－320.

［19］趙明曉，范國強.蠟梅SSR反應體系建立及引物篩選［J］. 河南農業(yè)大學學報，2011，45(1):46 －50.

［20］趙 冰，張啟翔.蠟梅AFLP分子標記技術體系的建立［J］. 武漢植物學研究，2007，25(1):93－97.

［21］單麗麗，肖 敏，陸瑞菊，等.古臘梅AFLP分子標記體系的建立及應用［J］.上海農業(yè)學報，2008，24(3):25－29.

［22］周明芹，楊琴軍，陳龍清.蠟梅AFLP－銀染體系的建立與優(yōu)化［J］.華中農業(yè)大學學報:自然科學版，2007，26(3):394 －398.

［23］張延召，曹喜兵，翟曉巧，等.適用于AFLP分析的泡桐DNA提取方法研究［J］.河南農業(yè)大學學報，2009，43(6):610 －614.

［24］曹喜兵，何 佳，翟曉巧，等.泡桐AFLP反應體系建立及引物篩選［J］.河南農業(yè)大學學報，2010，44(2):368－371.