鹿茸水提取物及其蛋白酶解物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

趙 磊, 王成濤, 籍保平

鹿茸是我國(guó)有史記載以來(lái)的名貴動(dòng)物藥之一,與人參、冬蟲(chóng)夏草并列為三大補(bǔ)品,在國(guó)內(nèi)外享有很高聲譽(yù).鹿茸做為保健品,具有生精補(bǔ)髓、養(yǎng)血益陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨、延年益壽等功效.研究報(bào)道,鹿茸中主要含有蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、氨基酸、磷脂、糖類(lèi)、固醇類(lèi)、激素樣物質(zhì)、核酸、多胺及各種無(wú)機(jī)物質(zhì)[1-2].

鹿茸水提取物是鹿茸最為廣泛的服用形式之一[3].研究報(bào)道,鹿茸水提取物有著較好的免疫調(diào)節(jié)作用.金光湖等[4]報(bào)道鹿茸水提取物可增強(qiáng)遲發(fā)性免疫反應(yīng),并可增加脾細(xì)胞中玫瑰花結(jié)細(xì)胞的數(shù)量,同時(shí)可顯著提高綿羊紅細(xì)胞的凝集素值和溶血素值,對(duì)細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能有促進(jìn)作用.然而,韓國(guó)學(xué)者[5-6]在研究鹿茸水提取物對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的作用時(shí),發(fā)現(xiàn)鹿茸水提取物具有免疫抑制作用.Kim等[6]報(bào)道鹿茸水提取物體外可以抑制抗原刺激的T細(xì)胞活化,并在高濃度下能夠降低巨噬細(xì)胞的吞噬作用.可見(jiàn),鹿茸對(duì)免疫系統(tǒng)可能具有雙向調(diào)節(jié)作用,從而使人體內(nèi)環(huán)境達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài).我們前期研究發(fā)現(xiàn),鹿茸水提取物在模擬胃腸消化過(guò)程中,隨著蛋白質(zhì)逐漸酶解,其對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用消失,對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)[7],但具體原因還有待進(jìn)一步闡明.

本研究報(bào)道了鹿茸水提取物中非蛋白成分(AEVA-S)、粗蛋白酶解物及分離組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響,并進(jìn)行了初步鑒定,旨在探討其免疫調(diào)節(jié)活性及功能成分,為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鹿茸凍干超微粉,東北大興安嶺區(qū)科技局;SPF級(jí)Balb/c小鼠(合格證號(hào):SCXK-(軍)2007-004),6～8周齡,雄性,中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;胃蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶、刀豆蛋白 A(ConA),美國(guó) Sigma化學(xué)公司;RPMI-1640高糖培養(yǎng)基,美國(guó)Gibico公司;青鏈霉素混合液、紅細(xì)胞裂解液、CCK-8試劑盒、Hepes,碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;超濾管,德國(guó)Sartorius公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

LGJ-18型冷凍干燥機(jī),軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠;XDOS-1B型倒置顯微鏡,重慶光電有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱,日本Sanyo公司;Multiskan MK3型自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;TGL-20M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),湘儀離心機(jī)廠;SHIMADZU LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿茸水提取物非蛋白成分及粗蛋白的制備

根據(jù)有機(jī)溶劑沉淀法[8],略做調(diào)整,將AEVA-S和粗蛋白進(jìn)行分離.向鹿茸水提取物的水溶液中緩慢加入無(wú)水乙醇,使乙醇終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%,4℃靜置過(guò)夜.將懸浮液以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min,沉淀物用75%乙醇洗滌.上清液和沉淀物分別進(jìn)行冷凍干燥,得到AEVA-S和粗蛋白,冷凍干燥物粉末于4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 鹿茸水提取物非蛋白成分分離組分的制備[9]

采用半制備RP-HPLC技術(shù)對(duì)AEVA-S進(jìn)行分離,得到AEVA-S(Ⅰ～Ⅴ)的半制備HPLC圖譜,見(jiàn)圖1.色譜條件:色譜柱采用Kromasil C18(10×250 mm,5μm),流動(dòng)相A為0.1%TFA水溶液,流動(dòng)相B為0.1%TFA乙腈溶液,流速為3 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm,洗脫梯度為0～5%A,0～30 min;5% ～50%A,30～40 min;50%A,40～50 min.

1.2.3 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物及其分離組分的制備

采用蛋白酶水解鹿茸水提取物粗蛋白6 h,制備不同的蛋白酶酶解物.鹿茸水提取物中粗蛋白以50 g/L的質(zhì)量濃度溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、pH值,加入一定量的蛋白酶進(jìn)行水解.水解過(guò)程中通過(guò)不斷加入1 mol/L NaOH或HCl來(lái)保持pH值不變,并保持溫度恒定.胃蛋白酶、胰酶及堿性蛋白酶的反應(yīng)條件見(jiàn)圖2.

圖1 鹿茸水提取物中非蛋白成分的半制備HPLC圖譜Fig.1 Semi-preparative HPLC chromatogram at 260 nm of AEVA-S.

圖2 鹿茸水提取物的不同粗蛋白酶解物的制備流程Fig.2 Flow chart for the preparation of AEVA crude protein hydrolysates

采用超濾法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離,稱取一定量鹿茸水提取物粗蛋白的不同酶解產(chǎn)物,選用截留分子量為10,5,3 kDa的超濾膜分別超濾,將超濾后不同分子量范圍的酶解產(chǎn)物分別收集并冷凍干燥.

1.2.4 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備

將小鼠(Balb/c)拉頸處死,無(wú)菌分離完整脾臟,用PBS沖去浮血,剝除結(jié)締組織及脂肪成分.脾組織剪碎后置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網(wǎng)上,用注射器針芯研磨,PBS液洗滌,用吸管收集沖洗液至離心管,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,加入3 mL紅細(xì)胞裂解液,靜置2 min,加入10 mL PBS終止反應(yīng),1 200 r/min離心5 min,棄上清液.用PBS液洗兩次,不完全RPMI-1640洗一次,加適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10 mM Hepes)重懸細(xì)胞.調(diào)整濃度至2×106個(gè)細(xì)胞/mL,臺(tái)盼蘭染色測(cè)細(xì)胞存活率大于95%.

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將脾細(xì)胞懸液按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中,再添加10μL ConA(終質(zhì)量濃度為5μg/mL)或不添加ConA,10μL樣品溶液,每個(gè)處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔.同時(shí)做正常對(duì)照組和ConA對(duì)照組,正常對(duì)照組為100μL脾細(xì)胞懸液,ConA對(duì)照組是在100μL細(xì)胞懸液中添加10μL ConA(終質(zhì)量濃度為5μg/mL).然后將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.

1.2.6 細(xì)胞增殖程度的測(cè)定及計(jì)算分析

選用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖程度.結(jié)果用刺激指數(shù)(Simulation index,SI)表示,計(jì)算如下:

1.2.7 液質(zhì)聯(lián)用分析

HPLC條件:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,柱溫30℃;流動(dòng)相A相:0.05%甲酸水溶液,B相:0.05%甲酸乙腈溶液.梯度洗脫條件:(1)AEVA-SⅢ:0～5%A,0～30 min;(2)AEVA-SⅣ:0～5%A,0～30 min;5%～50%A,30～40 min;50%A,40～48 min.

質(zhì)譜條件:microTOF-QⅡ四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀.電噴霧離子源(ESI)噴射電壓為4.5 kV;正離子模式;噴霧壓力為0.6 bar;干燥氣(N2)流速為7 L/min,溫度為180℃;離子掃描范圍為50～1 000 m/z.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±S.D.)表示,采用組間t檢驗(yàn),P＜0.05具有顯著性差異,P＜0.01具有極顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 鹿茸水提取物中非蛋白成分及其分離組分免疫調(diào)節(jié)功能的研究

本研究通過(guò)體外各分離組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響來(lái)評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)作用.各分離組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖3.結(jié)果表明,低、高濃度的AEVA-S單獨(dú)作用均可顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖,SI值分別為1.05±0.03和1.13±0.02,與空白對(duì)照組相比增長(zhǎng)了5%(P＜0.05)和13%(P＜0.01).低、高劑量的AEVA-S(Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ)本身均對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖無(wú)影響.高劑量的AEVA-SⅢ本身對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P＜0.05),抑制率為4.5%.推測(cè)AEVA-S本身對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是其各分離組分協(xié)同作用的結(jié)果.

圖3 非蛋白分離組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Effects of separated fractions from AEVA-Son the proliferation of murine splenocytes

由圖3可知,低、高濃度的AEVA-S,SⅠ,SⅡ均對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖無(wú)影響.然而,低、高濃度的 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ可顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖,尤以高濃度時(shí)最為明顯.在高濃度時(shí)(200μg/mL),AEVA-SⅢ和AEVASⅣ對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了58.4%和36.5%.高濃度的AEVA-SⅢ對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的高抑制率與其本身具有脾細(xì)胞毒性有關(guān).此外,AEVA-SV在低劑量時(shí)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖無(wú)影響,而在高劑量時(shí)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用.

ConA是T淋巴細(xì)胞的有絲分裂原,可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化,進(jìn)而使細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子合成、細(xì)胞因子受體表達(dá)、細(xì)胞分化及細(xì)胞增殖等變化.T淋巴細(xì)胞是一類(lèi)胸腺依賴型淋巴細(xì)胞,是血液和再生循環(huán)中的主要淋巴細(xì)胞,它在接受抗原刺激后可以發(fā)生特異性免疫應(yīng)答.T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答主要針對(duì)細(xì)胞內(nèi)微生物的感染,也參與Ⅳ型超敏反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展.機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量越大,增殖活性越高,機(jī)體由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能越強(qiáng)[10].

絕大多數(shù)研究表明,在加入樣品的同時(shí)加入ConA,樣品的免疫調(diào)節(jié)活性較大.本研究結(jié)果顯示,鹿茸水提取物非蛋白分離組分——AEVA-SⅢ或AEVA-SⅣ與ConA同時(shí)加入,淋巴細(xì)胞增殖受到強(qiáng)烈抑制.Barta等[11]報(bào)道將乳清蛋白制劑與絲裂原同時(shí)加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí),淋巴細(xì)胞增殖被抑制,而將絲裂原與淋巴細(xì)胞共同孵育一定時(shí)間后再加入乳清制劑,則其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用變得不明顯.發(fā)生該現(xiàn)象的機(jī)理有待進(jìn)一步探討,推測(cè)是由于樣品影響了小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的敏感性或是由于樣品預(yù)先與小鼠脾細(xì)胞膜上的ConA受體相結(jié)合,影響了ConA與小鼠脾細(xì)胞間的作用,使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中斷,甚至根本不能形成,從而抑制了細(xì)胞的活化和增殖.后續(xù)實(shí)驗(yàn)可采取先加樣品再加ConA的順序,來(lái)驗(yàn)證AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的抑制作用.

2.2 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ成分的初步鑒定

AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ的 HPLC-ESI-HRMS分析見(jiàn)表1.結(jié)合已報(bào)道鹿茸中存在的成分[1]以及質(zhì)譜結(jié)果,初步鑒定AEVA-SⅢ中主要含有8種化合物,分別為:鳥(niǎo)嘌呤、胞苷、黃嘌呤、尿苷、3′-AMP、2′-AMP 、3′-GMP 和 2′-GMP;初步鑒定 AEVA-SⅣ中主要含有5種化合物,分別為:腺嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)苷、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷.

表1 AEVA-SⅢ和AEVA-SⅣ主要成分的正離子HRMS分析Tab.1 Positive ion HRMSanalysis of main compounds in AEVA-SⅢ and AEVA-SⅣ

2.3 不同酶解產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)功能的比較

分別選取100μg/mL和500μg/mL兩個(gè)質(zhì)量濃度,測(cè)定3種酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果如圖4.在100μg/mL的質(zhì)量濃度下,3種酶解產(chǎn)物單獨(dú)均不能刺激小鼠脾細(xì)胞增殖.質(zhì)量濃度為500μg/mL時(shí),堿性蛋白酶酶解物單獨(dú)均可刺激小鼠脾細(xì)胞增殖,并有顯著性差異(P＜0.05).在低濃度和高濃度的條件下,3種酶解產(chǎn)物均可以抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖,抑制程度有所不同,且存在一定的量效關(guān)系.在低濃度下,對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的抑制程度相對(duì)于高濃度時(shí)較低.在3種酶解產(chǎn)物中,堿性蛋白酶酶解物對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的抑制程度遠(yuǎn)低于其他兩種酶解產(chǎn)物.

圖4 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.4 Effect of AEVA crude protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes

同種蛋白不同酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性差別取決于水解用酶的種類(lèi)[12].肽的氨基酸組成、數(shù)量和序列對(duì)免疫活性也有重要影響,較強(qiáng)的疏水作用可能促使免疫活性肽與細(xì)胞膜相互作用而增強(qiáng)其免疫活性[13]. 疏水性氨基酸有 Tyr、Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Pro和Ala.疏水性氨基酸在酶和基質(zhì)、抗體和抗原間的相互作用等各種非共價(jià)鍵的分子結(jié)合方面,具有重要作用.堿性蛋白酶和中性蛋白酶可為制備出肽鏈末端具有疏水性氨基酸的小肽提供先決條件.

2.4 不同酶解產(chǎn)物分子量分布的比較

采用超濾法分析3種蛋白酶酶解產(chǎn)物中大于10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa及小于3 kDa肽段的分子量分布,見(jiàn)圖5.數(shù)據(jù)表明,3種蛋白酶酶解物中主要由5～10 kDa及3 kDa以下肽組成,分別占總組成的30%以上.各蛋白酶解物以模擬胃腸消化物中大分子肽段含量最高,10 kDa以上肽段占總量的23.07%;而堿性蛋白酶水解物中10 kDa以上肽段僅占總量的5.3%,小分子肽段(＜5 kDa)達(dá)到了總量的62.5%.改變酶的水解順序也可影響酶解物的分子量分布.與模擬胃腸消化物相比,胰酶-胃蛋白酶酶解物中的大分子肽段(＞5 kDa)含量減少,同時(shí)小分子肽段(＜5 kDa)含量增加.在相同的時(shí)間內(nèi)(6 h),堿性蛋白酶對(duì)鹿茸水提取物中粗蛋白水解程度最大.

圖5 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物相對(duì)分子量分布Fig.5 Molecular size distribution of AEVA crude protein hydrolysates

2.5 不同分子量范圍肽段免疫調(diào)節(jié)活性研究

不同分子量范圍肽段 1(MW ＞10 kDa)、2(MW:5～10 kDa)、3(MW:3～5 kDa)和4(MW ＜3 kDa)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖活性的影響見(jiàn)圖6.研究結(jié)果表明,不同分子量范圍肽段1,2,3和4單獨(dú)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響不同.分子量＞10 kDa的肽段在高、低濃度下單獨(dú)均能刺激小鼠脾細(xì)胞增殖,呈現(xiàn)絲裂原作用;其他分子量范圍肽段(2,3和4,除B4外)單獨(dú)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖均無(wú)影響.這與Mercier和Diane等的研究結(jié)果一致,Mercier等[13]和Diane等[14]在小鼠脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn),分子量大于10 kDa的乳清蛋白和分子量小于2 kDa的酶解肽類(lèi),均能夠明顯促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖,且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性.胰酶-胃蛋白酶聯(lián)合酶解物中B4(分子量＜3 kDa的肽段)單獨(dú)亦對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,這可能與肽的氨基酸組成有關(guān).

不同酶解物中不同分子量肽段對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響不同.圖6(a)顯示了模擬胃腸消化物中不同分子量肽段對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響.A1(分子量＞10 kDa的肽段)在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖,并有顯著性差異.其他分子量肽段(A2,A3和A4)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響.

圖6(b)顯示了胰酶-胃蛋白酶聯(lián)合酶解物中不同分子量肽段對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果表明,B1和B4(分子量＞10 kDa和＜3 kDa的肽段)在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖,并有顯著性差異.B2和B3(分子量在5～10 kDa、3～5 kDa的肽段)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響.

圖6 鹿茸水提取物粗蛋白酶解物中不同分子量肽段對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of peptide fractions with different MW from AEVA crude protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes

此外,堿性蛋白酶酶解物中不同分子量肽段對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖6(c).我們發(fā)現(xiàn),C1,C2,C3和C4在高、低濃度下均能夠抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖,并有顯著性差異.造成這種現(xiàn)象的原因有:1)肽段影響了小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的敏感性;2)酶解產(chǎn)物預(yù)先與小鼠脾淋巴細(xì)胞膜上的ConA受體結(jié)合,影響了ConA與小鼠脾淋巴細(xì)胞間的作用,使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中斷,從而抑制了細(xì)胞的活化和增殖.發(fā)生該種現(xiàn)象的機(jī)理有待進(jìn)一步探討.

上述結(jié)果表明,肽段的分子量是影響小鼠脾細(xì)胞增殖的主要因素之一.此外,酶解選用酶的種類(lèi)也是重要影響因素.不同蛋白酶的底物特異性不同,酶切位點(diǎn)各異,酶的選擇影響了蛋白酶解物中肽段的分子量大小及氨基酸組成,從而導(dǎo)致的酶解產(chǎn)物免疫活性的差異.總的來(lái)說(shuō),鹿茸蛋白酶解物中大分子量肽段(＞10 kDa)對(duì)小鼠脾細(xì)胞的免疫活性影響最大.在有或無(wú)有絲分裂原存在時(shí),酶解產(chǎn)物對(duì)脾淋巴細(xì)胞的作用差異機(jī)制還有待探討.酶解過(guò)程中釋放出的生物活性肽的氨基酸組成和肽序還需進(jìn)一步研究.

3 結(jié) 論

本研究主要針對(duì)鹿茸水提取物,將其分為大分子蛋白和小分子非蛋白成分進(jìn)行研究.以提高蛋白質(zhì)功能活性為目的,采用多種蛋白酶對(duì)粗蛋白進(jìn)行酶解.非蛋白成分和粗蛋白酶解物分別采用HPLC和超濾法進(jìn)行分離,并研究各分離組分對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖作用的影響,初步評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)活性.結(jié)果表明,鹿茸水提取物非蛋白成分對(duì)未經(jīng)絲裂原誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用優(yōu)于其分離組分,對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響.Fr.Ⅲ和Ⅳ對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用,初步鑒定均為堿基和核苷酸的混合物.分子量大于10 kDa的肽段,單獨(dú)可刺激小鼠脾細(xì)胞增殖,且對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用.分子量小于10 kDa的肽段,單獨(dú)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖無(wú)影響,對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用不同,但總體相對(duì)較弱.肽段分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性影響較大,但并沒(méi)有呈現(xiàn)直接的相關(guān)性.肽的氨基酸組成、序列及構(gòu)型等等也是影響其活性的重要因素.

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