GC-MS法同時測定生鮮乳中三聚氰胺及其類似物的研究

浙江省飼料監(jiān)察所 朱聰英 應永飛 羅成江 周 煒陳慧華 韋敏玨 林仙軍

三聚氰胺是一種重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺樹脂，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。2008年三鹿嬰幼兒奶粉事件將三聚氰胺與食品安全，特別是乳品安全聯(lián)系到了一起。三聚氰胺本身的毒性較低，而三聚氰胺與三聚氰酸同時攝入體內(nèi)，就會產(chǎn)生很嚴重的后果。二者能夠依靠分子結(jié)構(gòu)上的羥基與氨基之間形成水合鍵，生成不溶于水的三聚氰胺氰尿酸鹽，能在腎小管中沉淀從而形成腎結(jié)結(jié)石（Heller和 Nochetto，2008）。因此，同時檢測乳品中三聚氰胺及其類似物比單純檢測三聚氰胺更有實際意義。目前國內(nèi)乳品中三聚氰胺檢測標準已經(jīng)建立，但有關三聚氰胺及其類似物同時檢測的研究較少。

目前較常見的以三聚氰胺（MEL）、三聚氰酸（CYA）、三聚氰酸一酰胺（AMD）、三聚氰酸二酰胺（AMN）為目標物，三聚氰胺檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法 （Lutter等，2011），高效液相色譜法（GB/T 22388-2008； Yu 等，2010）、 氣相色譜-質(zhì)譜法 （Miao等，2009）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Anderson 和 Turnipseed，2008；Michael 等 ，2007）。本研究建立了氣相色譜－質(zhì)譜法 （GCMS），另外對生鮮乳中三聚氰胺及其類似物進行定性、定量檢測。同時，為了提高定性和定量的準確性，實驗采用13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA為內(nèi)標，提高了定性和定量的準確性。并對氣相色譜-質(zhì)譜法的回收率和重復性進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 GC6890N-5973氣相色譜-質(zhì)譜儀（帶自動進樣器）：美國安捷倫（Agilent）公司，配MSD ChemStation工作站，NIST2.0a譜庫；Sigma 3 k18冷凍離心機；MS2 minishaker漩渦混勻器；METTLER AG-285電子天平；氮吹儀。

1.2 材料與試劑 三聚氰胺標準品，購自國家標準物質(zhì)研究中心；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺標準品，購自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于 98.0%；內(nèi)標物13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA 購自 Cambridge Isotope Laboratories Inc.，均為 100 μg/mL 標準溶液；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），美國SUPELCO公司提供；吡啶：色譜純，購自國家標準物質(zhì)研究中心；實驗用水為milli-Q超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 標準溶液的配制 分別精確稱取三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺各10 mg于100 mL容量瓶中，三聚氰胺、三聚氰酸用水溶解后定容，三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺用2%氨水溶液溶解后定容，為標準儲備液，置于0℃冰箱中保存。分別吸取適量的各標準品儲備液置于同一容量瓶中，用甲醇溶解后定容，搖勻，為標準工作液，使用時用甲醇稀釋至所需濃度即可。內(nèi)標溶液配置成 10 μg/mL的13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA內(nèi)標工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度80℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至280℃保持5.0 min；進樣口溫度280℃；載氣（高純氦）流速：1.0 mL/min；不分流進樣，進樣量1.0 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度280℃；溶劑延遲時間6 min；采用選擇離子監(jiān)測（SIM）模式進行檢測。

1.5 樣品處理

1.5.1 試樣提取 稱取生鮮乳2.0 g（精確到0.01 g），置50 mL聚丙烯離心管中，加內(nèi)標工作液100 μL；加提取液（乙腈∶水∶二乙胺=5∶4∶1，V/V/V）17.0 mL、飽和乙酸鉛溶液1.0 mL，10000 r/min以上均質(zhì)60 s，加蓋，于超聲波清洗器中超聲提取20 min；取出離心管，冷卻后8,000 r/min離心10min，取上清液1.5 mL至2.0 mL離心管中，14000 r/min高速離心30 min，再取上清液0.5 mL至5 mL具塞玻璃試管中，50℃氮氣吹干，殘余物備用。

1.5.2 試樣衍生和檢測 殘余物中加入吡啶100 μL和衍生化試劑100 μL，加塞后于渦旋混合器充分混勻，在75℃的烘箱中恒溫衍生60 min，取出后冷卻，加吡啶0.3 mL溶解供GC-MS分析。另取三聚氰胺及其類似物混合標準工作液適量，加內(nèi)標工作液100 μL，加空白樣品提取液0.2 mL后，氮氣吹干，與試樣同步進行衍生化。

1.6 結(jié)果計算 以峰面積按內(nèi)標法進行單點或多點校準定量，標準工作液和試樣液中被測物響應值均應在儀器檢測線性范圍內(nèi)。以13C3，15N3-CYA作為計算三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺濃度的內(nèi)標物；以13C3，15N3-MEL作為計算三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺濃度的內(nèi)標物。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定 由于三聚氰胺及其類似物都是沸點較高的極性物質(zhì)，且都含有-OH、-NH2等極性官能團結(jié)構(gòu)，直接采用氣相色譜進行分離較為困難。為改善各組分氣相色譜性質(zhì)，在進行儀器檢測前必須對樣品進行衍生化處理。經(jīng)BSTFA衍生化后，所含氨基、羥基上的氫均可被三甲基硅烷所取代，形成含有3個硅烷基結(jié)構(gòu)的衍生物（Tri-TMS），此時的色譜行為良好。衍生化后的4種化合物的質(zhì)譜圖和2種內(nèi)標物的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 三聚氰胺及其類似物和內(nèi)標物衍生物的質(zhì)譜圖（EI源）

在采用氣質(zhì)聯(lián)用技術進行多組分殘留測定時，即要充分考慮監(jiān)測離子的豐度以提高靈敏度，又要考慮盡量減少樣品基質(zhì)和不同化合物之間的離子干擾。由質(zhì)譜圖可知，三聚氰胺的衍生物在m/z342，327，171，285 有特征離子，這些碎片離子的比例關系可用于三聚氰胺的定性分析。定量離子采用m/z327，此特征離子豐度最高，有助于提高檢測的靈敏度，而且受雜質(zhì)的干擾較少。三聚氰酸一酰胺的衍生物在 m/z344，329，171，100 有特征離子，而三聚氰酸一酰胺二酰胺的特征離子m/z343，328，171，285； 三聚氰酸的特征離子有 m/z345，330，100，346；雖然三聚氰酸 m/z147 離子的響應值較高，但由于干擾非常嚴重，故未采用。三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸相應的定量離子均采用基峰，分別為m/z344、343和345。

與被檢測化合物相比，內(nèi)標物以定量為主，為了提高檢測的靈敏度，內(nèi)標物可以選擇兩個監(jiān)測離子，以盡可能消除對被檢測化合物的干擾。13C3，15N3-MEL 的監(jiān)測離子為 m/z348，333，定量離子為 348。13C3，15N3-CYA的 監(jiān)測 離子 為m/z351，336，定量離子為351。由于6種化合物的選擇監(jiān)測離子較多，同時監(jiān)測這6種化合物的所有離子，勢必影響儀器對單個離子的采集速率，從而降低檢測方法的靈敏度。根據(jù)部分化合物之間色譜保留時間相差較大的特點，可以將監(jiān)測離子分組進行掃描監(jiān)測，以提高檢測的靈敏度。4種三聚氰胺及其類似物和內(nèi)標物的保留時間和質(zhì)譜條件，見表1。

表1 三聚氰胺及其類似物和內(nèi)標物的保留時間和質(zhì)譜條件

2.2 氣相色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇 測定TMS衍生化后的三聚氰胺及其類似物一般采用HP-5MS或HP-1MS等非極性或弱極性的毛細管柱。實驗先后用（1）HP-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm 柱 ； （2）HP-1MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱進行實驗。 實驗按不同的色譜柱采用各自最優(yōu)化的分離條件，對色譜分離條件進行比較，發(fā)現(xiàn)（1）柱的分離效果更佳，各組分都得到了完全分離。因此，最后選用HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱。

2.2.2 柱溫的選擇 為了提高檢測的靈敏度，需對被測組分進行有效分離，從而實現(xiàn)分段采集。經(jīng)過實驗，優(yōu)化柱溫和程序升溫速率等參數(shù)，最后確定升溫程序為：初始溫度80℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至 280℃保持5.0 min；在此條件下，可使4種物質(zhì)在一次分析中全部分離，可以實現(xiàn)分段采集，見圖2。

圖2 三聚氰胺類似物標準品（1）、加樣標樣品（2）、空白樣品（3）的衍生物總離子流圖

2.3 凈化條件的確定 目前，為了避免三聚氰胺和三聚氰酸的氨基與羥基之間發(fā)生聚合反應，形成不溶解的水合物，生鮮乳中三聚氰胺及其類似物測定普遍在酸性或堿性溶液條件下，由水相和乙腈等組成混合提取劑，水相主要包括三氯乙酸溶液、乙酸鉛溶液和二乙胺溶液等。乙腈具有一定的沉淀蛋白質(zhì)作用，可以除去樣品中的部分蛋白質(zhì)，但從實驗結(jié)果來看，當乙腈相含量過高時，三聚氰酸和三聚氰胺往往容易形成網(wǎng)狀聚合物而沉淀，從而降低提取效果并最終影響的回收率和穩(wěn)定性。20%二乙胺/乙腈、2%三氯乙酸/乙腈、2.2%乙酸鉛/乙腈和乙腈水溶液等提取劑的提取效果進行了對比，結(jié)果表明，在酸性或堿性條件下均有較好的回收率，而乙酸鉛沉淀蛋白時效果最佳，因此，選用20%二乙胺/乙腈為提取劑，通過對提取液比例的優(yōu)化，最終選擇20%二乙胺/乙腈比例為1∶1(V/V)，并采用1 mL飽和乙酸鉛溶液沉淀蛋白質(zhì)。

2.4 衍生化 目前，常用的TMS衍生化試劑有N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺和N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1，V/V），通過比較，兩者之間的差別不大，而BSTFA更為常用且便宜，所以采用BSTFA為衍生化試劑。對衍生溫度和時間進行優(yōu)化后，最后采用75℃恒溫衍生60 min。

2.5 方法線性方程和檢出限 取適量標準工作液和內(nèi)標工作液，配置成三聚氰胺及其類似物上機液濃度為20～1000 ng/mL水平進行測定，內(nèi)標物的濃度為 100 ng/mL， 以13C3，15N3-CYA（m/z 351）計算 CYA（m/z 345）和 AMD（m/z 344）的濃度，以13C3，15N3-MEL（m/z 348）計算三聚氰胺（m/z 342）和三聚氰酸二酰胺（m/z 343）的濃度。以所得峰面積的比值與被檢化合物的濃度繪制標準曲線和回歸方程，結(jié)果表明所得的相關系數(shù)均在0.999以上。以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限。采用空白基質(zhì)添加被測物的方法進行計算，方法標準曲線和檢出限見表2。

表2 三聚氰胺及其類似物的線性方程、相關系數(shù)和檢出限(n=6)

2.6 回收率實驗 采用本研究建立的實驗方法，對添加了 0.5、1.0、5.0、50.0 mg/kg 等不同濃度三聚氰胺及其類似物的生鮮乳中進行重復性實驗。每個濃度取5份平行樣品，同時進行空白試樣，根據(jù)上述方法進行提取、凈化和測定，以內(nèi)標法計算方法的回收率，并計算批內(nèi)相對標準偏差。方法回收率、精密度和定量限見表3。

表3 生鮮乳中三聚氰胺及其類似物的添加回收率和精密度

以上結(jié)果表明，采用本方法檢測生鮮乳中的三聚氰胺及其類似物，添加濃度為0.50～50 mg/kg時，方法的回收率為62.0%～110.0%，各樣品平行間的變異系數(shù)為2.4%～13.9%，定性能滿足規(guī)定的要求，說明本方法的重復性好，同時各濃度樣品峰的分離度也很理想。

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