利用大孢子技術(shù)培育黃瓜單倍體的前期研究

盛 慧

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院，黑龍江哈爾濱 150070）

培育抗逆性強、抗多種病害、適應性廣、產(chǎn)量高且商品性好的黃瓜新品種是黃瓜育種工作的核心任務[1]。傳統(tǒng)的育種方法費時、費力且效率較低，加之資源匱乏，選育品質(zhì)好、產(chǎn)量高的新品種就變得更加困難。采用單倍體育種方法進行品種選育彌補了傳統(tǒng)育種的許多不足，成為人們關(guān)注的焦點。由于單倍體植株的基因型和表現(xiàn)型完全一致,大大降低了誤選頻率[2]；而且以單倍體為誘變材料,突變隱性基因性狀就可表現(xiàn)出來，獲得突變體的速度可大大加快，從而縮短了育種年限，并可快速產(chǎn)生純合的育種新材料（純系），為提高育種效率提供了可能；還可作為遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)良受體材料。但是，由于單倍體培育受到諸多因素的影響，造成單倍體育種進展緩慢。到目前為止，國內(nèi)還沒有完整的黃瓜單倍體育種體系，雖然報道較多，但重復性均較差，更沒有見到單倍體育種的后續(xù)研究。由此可以說明，單倍體育種在國內(nèi)仍屬于未攻克的學術(shù)難題[3]。本研究利用黃瓜未授粉子房（胚珠）培養(yǎng)，即所謂的大孢子[4]培養(yǎng)技術(shù)誘導黃瓜單倍體。經(jīng)長時間的努力，確定了預培養(yǎng)的必要性和培養(yǎng)基及不同基因型預培養(yǎng)的條件，并確定了胚狀體誘導的高效培養(yǎng)基，誘導率可達92%。文章總結(jié)了試驗中遇到的問題及相應的解決方法，為后續(xù)的器官分化和生根培養(yǎng)打下一個堅實的基礎[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料：津園5號（華南型）、哈研2186（歐洲溫室型）、均由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院黃瓜分子育種實驗室提供。

1.1.2 試劑：外源調(diào)節(jié)劑均購自北京益利公司。

2.2 方法

2.2.1 外植體的處理及滅菌：于早上8點到9點之間將次日要開花的子房采摘下來，采摘后立即進行消毒處理。津園5號在消毒前除去掉雌花外還需將刺溜刮去，原因有以下兩點：一是除菌效果不好，即使添加表面活性劑也不易除去刺溜中間的細菌；二是刺溜吸收養(yǎng)分的能力強于胚珠，因此在培養(yǎng)中就會出現(xiàn)由刺溜發(fā)育而來的愈傷組織，而胚珠部分因無法吸收到營養(yǎng)而褐化死亡的現(xiàn)象。外植體滅菌過程中氯化汞的使用時間不要超過5min，否則影響預培養(yǎng)的效果。

2.2.2 預培養(yǎng)：預培養(yǎng)對于胚狀體的誘導極為重要。不同基因型在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上沒有明顯差異，但在培養(yǎng)條件上差異顯著。津園5號預培養(yǎng)只需將子房塊接種于預培養(yǎng)培養(yǎng)基上，放于室溫下培養(yǎng)即可，光照時間16h/8h，1500~2000lx。哈研2186將子房塊接種在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上后，需放置在恒溫培養(yǎng)箱中，35℃暗培養(yǎng)3天[6，7]，而后放于室溫下培養(yǎng)。子房塊的大小對于誘導效果也至關(guān)重要，應盡量保持一致，一般1~2mm最佳，過大無胚珠膨大現(xiàn)象，過小子房塊會干癟死亡。預培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/LTDZ+0.1mg/L NAA，4%Sugar，0.8%Agar。

2.2.3 胚狀體誘導：子房塊在預培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)接到胚狀體誘導培養(yǎng)基上。誘導培養(yǎng)基中的外源調(diào)節(jié)劑的種類和計量是一個需要反復摸索的重要因素，尤其是生長素和細胞分裂素的對比情況[8，9]（詳見表1）。經(jīng)過7~10天的培養(yǎng)，津園5號的胚珠會出現(xiàn)明顯膨大現(xiàn)象，并且周圍的表皮組織白化死亡。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后會發(fā)現(xiàn)，胚狀體突破珠被向上生長并且始終保持鮮綠狀態(tài)。哈研2186經(jīng)過10~15天的培養(yǎng)后可見胚珠膨大現(xiàn)象，但不如津園5號明顯。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后胚狀體突破珠被向上生長，但數(shù)量少于津園5號。其中，津園5號胚狀體誘導率可達92%，哈研2186略少（詳見表 2）。

表1 誘導培養(yǎng)基中外源調(diào)節(jié)劑配比情況

表2 不同外源調(diào)節(jié)劑對誘導效率的影響

3 結(jié)果與分析

3.1 預培養(yǎng)

不進行預培養(yǎng)的子房塊胚珠沒有膨大現(xiàn)象，更沒有胚狀體的形成，可見預培養(yǎng)對于啟動雌核發(fā)育起到相當重要的作用。

3.2 胚狀體誘導

對于不同基因型而言，胚狀體的形成時間是有一定差異的。例如，華南型黃瓜胚狀體的形成要早于歐洲溫室型。具體原理還有待于進一步研究。

誘導培養(yǎng)基中生長素/細胞分裂素的比值在胚狀體誘導過程中起著相當重要的作用。隨著比值的減小，胚狀體誘導率逐漸增減，當比值為1時，胚狀體誘導率達到92%。但是有一點必須注意，雖然誘導率提高了，但隨著比值的接近，愈傷組織量也在逐漸增加。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，愈傷組織會出現(xiàn)硬化、死亡現(xiàn)象，并且影響胚狀體的進一步生長。說明生長素/細胞分裂素的比值對于胚狀體的繼續(xù)生長和器官分化起著關(guān)鍵的作用。因此，不能盲目追求高誘導率。試驗中發(fā)現(xiàn)6號培養(yǎng)基和1號培養(yǎng)基誘導率雖然只有72%和84%，但是胚狀體的生長速度較其他培養(yǎng)基快，可作為最終的誘導培養(yǎng)基。

3.3 分化培養(yǎng)

待綠胚形成后立刻將種皮去掉，并將胚小心轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基為MS+0.20 mg/L 6-BA+30 g/L Suc+0.8%Agar，pH 5.8。培養(yǎng)條件為：溫度 22 ℃~25℃，光/暗周期為14 h/10 h。5~7天后便可觀察到有植株形成。不同基因型對分化效率具有一定影響，具體情況見表3。

表3 基因型對分化效率和成苗效率的影響

4 存在的問題及展望

4.1 存在的問題

4.1.1 季節(jié)：季節(jié)對于單倍體培育有一定影響?？傮w來說，秋季的誘導率要高于春季，且不易污染，但時間較短。冬季的誘導效果一般，但污染率低，接種后最好放于人工氣候箱中。

4.1.2 基因型：基因型不同誘導效果有差異，但不是造成單倍體培育困難的關(guān)鍵因素。同一種培養(yǎng)基可以誘導不同的基因型，只是誘導效率高低不同而已，但差距不會很懸殊。

4.1.3 培養(yǎng)基：歸根結(jié)底，導致單倍體培育失敗的原因還是我們沒有找到合適的培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基選擇中，MS要好于N6和White；培養(yǎng)基中外源調(diào)節(jié)劑的種類及含量直接影響著試驗的成敗。胚狀體在進行器官分化時要適當減少2，4-D的用量。

4.1.4 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件各文獻報道中沒有明顯差異，均為室溫（25±1）℃，光照 1500~2000 lx。

4.2 展望

單倍體培育對于研究作物遺傳育種起著重要的作用[10~12]。它在新品種培育方面、親本鑒定方面以及分子生物學研究方面意義重大[13，14]。目前，國外在單倍體培育方面已取得了相當大的成績[15]；而國內(nèi)還處于研究階段，雖屢見報道但重復性較差。單倍體育種工作道路艱難，作為育種工作者還須繼續(xù)努力，探討出誘導效率高且重復性較好的培養(yǎng)基，創(chuàng)造利于單倍體生長的優(yōu)越條件，為單倍體育種的后續(xù)研究打下一個堅實的基礎。

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