反相高效液相色譜法測定白芷提取分離物中歐前胡素含量

胡大強，侯麗娜，孟德勝，陳 亮，徐 靖

白芷為傘形科植物白芷 Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的干燥根，味辛，性溫，歸肺、胃、大腸經(jīng)，芳香升散，有祛病除濕、排膿生肌、活血止痛、抗炎、抑制病原微生物、抗腫瘤、保肝等多種藥理活性，近年來發(fā)現(xiàn)其具有清除自由基、增白及治療白癜風(fēng)的作用。白芷的主要有效成分為香豆素類化合物，其中歐前胡素的含量通常采用薄層色譜法測定。在白芷經(jīng)乙醇提取、大孔吸附樹脂分離后得到主要含歐前胡素的乙醇溶液基礎(chǔ)上，筆者采用高效液相色譜法測定其中歐前胡素的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 LC型高效液相色譜儀，包括G 1329 A標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器、G 1314 B型VWD檢測器(美國安捷倫科技有限公司)。歐前胡素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110826－200712);白芷(太極集團(tuán)重慶中藥飲片廠有限公司，批號為090212);甲醇(分析純，重慶川東化工有限公司，批號為0081104);甲醇(色譜純，西班牙Scharlau Chemie S.A.公司);藥用乙醇(四川金鷹實業(yè)有限公司，批號為090209)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1－2]

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB －C18柱(150 mm ×4.6 mm，7μm);流動相:0～6 min甲醇－水(65∶35)，6～15 min甲醇－水(55∶45)，15～25 min甲醇－水(65∶35);流速:1 mL/min;檢測波長:302 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20μL;理論板數(shù)為3 600。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備[3－4]

乙醇回流提取白芷總香豆素后，經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離得到歐前胡素含量較高的供試品溶液，按此方法制備供試品溶液3批。精密稱取歐前胡素對照品0.033 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。取上述溶液1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為660μg/mL的對照品貯備液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取2.2項下對照品貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾后，按2.1項下色譜條件測定。以峰面積積分值(Y)對歐前胡素質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=0.014 2 X+0.006 0，r=0.999 8(n=5)。結(jié)果表明，歐前胡素質(zhì)量濃度在66～330μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:取“線性關(guān)系考察”項下質(zhì)量濃度為198μg/mL的歐前胡素對照品溶液，分別于 0，0.5，1.0，2.0，4.0 h 時依法測定，結(jié)果的 RSD=0.59%(n=5)。

加樣回收試驗:在3個已知含量的歐前胡素供試品溶液1.0 mL的 10 mL 容量瓶中，分別精密加入歐前胡素貯備液 1.0，2.0，4.0 mL，甲醇定容至刻度，搖勻，即配成低、中、高質(zhì)量濃度的歐前胡素溶液，按2.1項下的色譜條件測定，結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取制備的3批歐前胡素提取物供試品溶液，分別精密吸取1.0 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，再精密吸取2.0 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾后依法測定。結(jié)果3批供試品溶液中歐前胡素的質(zhì)量濃度分別為1.01，0.98，0.92 g/L。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=15)

3 討論

曾參照2005年版《中國藥典》中的高效液相色譜法，但流動相中甲醇比例低，導(dǎo)致出峰時間過長，而供試品溶液雜峰較少，故增加甲醇比例;甲醇比例過高會導(dǎo)致歐前胡素峰與周圍峰分離度不高，為節(jié)省時間，選用梯度的流動相洗脫，即0～6 min甲醇－水(65∶35)，6～15 min甲醇 －水(55∶45)，15～25 min甲醇 －水(65∶35)。歐前胡素峰的理論板數(shù)、保留時間較理想，峰對稱性也符合要求。

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