超聲波提?。悴ㄩL(zhǎng)同步熒光法測(cè)定淡水藻中葉綠素a的含量

吳俊森 萬(wàn)修志 馬永山 孫韶華

(1．山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南250101;2．濟(jì)南市供排水監(jiān)測(cè)中心，山東濟(jì)南250033)

由于受到水源富營(yíng)養(yǎng)化的影響，我國(guó)許多以湖泊水庫(kù)為水源的給水廠原水含有不同程度的藻類，藻類會(huì)釋放藻毒素，威脅供水水質(zhì)的安全。葉綠素是藻類的主要光合色素，常見(jiàn)的是葉綠素a，其含量大約是藻干重的1% ～2%，是藻類生物量的重要指標(biāo)［1］。目前國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域采用的葉綠素a測(cè)定方法多采用分光光度法和普通熒光法，因分光光度法不如熒光法靈敏，現(xiàn)在多采用熒光法。但對(duì)綠藻來(lái)說(shuō)其色素種類較多，特別是存在葉綠素b，其熒光激發(fā)和發(fā)射光譜與葉綠素a有嚴(yán)重重疊，再加上噪音信號(hào)的干擾，利用普通熒光光譜很難單獨(dú)對(duì)葉綠素a進(jìn)行定性和定量分析［2］。

為避免其它色素光譜的干擾，人們多采用同步熒光法對(duì)葉綠素a的熒光光譜進(jìn)行測(cè)定［3］，該方法同時(shí)掃描熒光分光光度計(jì)的激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長(zhǎng)，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)(或發(fā)射波長(zhǎng))構(gòu)成光譜圖。與常規(guī)熒光法相比，同步熒光法能夠簡(jiǎn)化光譜，減少瑞利散射和拉曼散射的干擾，使譜峰變窄，從而提高了測(cè)定的選擇性和靈敏度。黃賢智等建立了葉綠素a和葉綠素b的同步熒光分析法并用于菜葉中兩種色素的測(cè)定［4］;唐堯基等應(yīng)用同步熒光法分析了海水中葉綠素a的含量［5］。同步熒光法用于綠藻中葉綠素a的測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此外，傳統(tǒng)葉綠素的提取，耗時(shí)長(zhǎng)且有可能提取不完全，近來(lái)，超聲波提取(也稱為萃取)以其提取溫度低、提取率高、提取時(shí)間短的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于中藥材和各種動(dòng)、植物有效含量的提取。我們通過(guò)比較不同提取方式發(fā)現(xiàn)，選擇小球藻為分析對(duì)象時(shí)，以90%丙酮為提取劑，采用超聲波提取法，可節(jié)省操作步驟，并有助于提高葉綠素提取效率。在此基礎(chǔ)上，本文以小球藻為例，建立了超聲波提取－同步熒光法測(cè)定綠藻中葉綠素a含量的新方法，其線性范圍為 0．02 ～1．25 mg/L，檢出限為1．6ug/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 供試生物材料與培養(yǎng)方法

本試驗(yàn)所用小球藻種由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供。采用一次性培養(yǎng)方法，溫度為25℃ ±1℃，光強(qiáng)為3000Lux，培養(yǎng)液采用SE培養(yǎng)基，用于實(shí)驗(yàn)的藻液為接種2次以上的已適應(yīng)上述生長(zhǎng)條件的處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻。

1．2 儀器與試劑

KQ250DB型浴槽式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TBL－40B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);0．45μm醋酸纖維濾膜(上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠)。F－4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)，掃描速度240 nm/min，帶通5nm;葉綠素a、葉綠素b(Sigma公司):分別用90%丙酮配制成1．0 mg/10mL的儲(chǔ)備液，保存于冰箱中(4℃)備用。所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

取適量葉綠素a、b標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，用90%丙酮稀釋至刻度，搖勻;采用熒光分光光度計(jì)，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定標(biāo)樣的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜以及同步熒光光譜。取培養(yǎng)好的小球藻溶液，加入體積為水樣5%的飽和碳酸鎂溶液，用0．45μm水溶性醋酸纖維濾膜減壓過(guò)濾，使小球藻截留在濾膜上，抽干，再加入10mL90%丙酮提取劑，蓋好，超聲波萃取0．5h(超聲功率:100%)，離心后取上清液進(jìn)行同步熒光法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 萃取方式對(duì)葉綠素提取效果的影響

研究了各種萃取方式包括加熱法、研磨法及超聲波萃取法等對(duì)葉綠素a提取效果的影響，結(jié)果證明當(dāng)以90%丙酮為提取劑，采用超聲波提取方式，可節(jié)省操作步驟及時(shí)間，并有助于提高葉綠素提取效率，比國(guó)家環(huán)?？偩帧端蛷U水監(jiān)測(cè)分析方法》推薦的研磨法提取效率高。

2．2 熒光光譜譜圖

分別掃描90%丙酮空白、小球藻浸泡液和葉綠素a－90%丙酮溶液的熒光光譜。采用λex=444nm掃描熒光發(fā)射光譜，λem=660nm掃描其熒光激發(fā)光譜，△λ=216nm掃描其同步熒光光譜;扣除90%丙酮后，得葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)液的熒光激發(fā)光譜、熒光發(fā)射光譜以及同步熒光譜圖(圖1)。

圖1 葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)液的熒光激發(fā)(實(shí)線)、發(fā)射(折線)及同步熒光(點(diǎn)線)光譜

分析小球藻提取液中的葉綠素a時(shí)，所分析的體系未經(jīng)提取、凈化等步驟，待測(cè)溶液存在一定的干擾，葉綠素a的激發(fā)和發(fā)射光譜受其它色素特別是葉綠素b的干擾而變形，峰形不如同步譜那樣完整。如圖2所示。因此選用同步熒光光譜用于分析小球藻提取液，比激發(fā)譜或發(fā)射譜更有利于在復(fù)雜的體系中區(qū)分出葉綠素a的信號(hào)。

2．3 葉綠素b干擾考察

考察了葉綠素b對(duì)葉綠素a同步熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響情況。在葉綠素a的90%丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(0．5mg/L)中加入 0．2mg/L、0．4mg/L、0．6mg/L、0．8mg/L、1．0mg/L 的葉綠素b，檢測(cè)加入后的熒光信號(hào)，并與未加葉綠素b的葉綠素a溶液的熒光信號(hào)作比較，結(jié)果表明，葉綠素a的同步熒光信號(hào)基本不受葉綠素b的影響。小球藻浸取液中還有其他色素物質(zhì)的存在，如葉黃素和胡蘿卜素等，這些物質(zhì)的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜與葉綠素a的沒(méi)有干擾，不對(duì)該分析體系造成明顯的影響。

圖2 小球藻浸泡液的熒光激發(fā)(實(shí)線)、發(fā)射(折線)及同步熒光(點(diǎn)線)光譜

在同一小球藻提取液樣品中加入不同量的葉綠素a，選用△λ=216nm進(jìn)行萃取液的同步熒光掃描，由同步熒光峰信號(hào)(高度)對(duì)應(yīng)其濃度繪制工作曲線，如圖3所示。葉綠素a的加入量與同步熒光峰強(qiáng)度F呈良好的線性關(guān)系，因此，同步熒光法對(duì)消除小球藻中存在的其他色素和干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響是非常有效的。同步熒光法用于測(cè)定綠藻中葉綠素a的含量是可行的。

圖3 葉綠素a加入量與熒光強(qiáng)度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．4 工作曲線及檢出限

采用同步熒光法對(duì)葉綠素a的90%丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行熒光掃描，由同步熒光峰信號(hào)(高度)對(duì)應(yīng)其濃度繪制工作曲線，其線性回歸方程為Y=3110．5x+198．48，相關(guān)系數(shù)為0．9991，線性范圍為0．02 ～1．25 mg/L。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定11份小球藻空白，根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算其檢出限為1．6ug/L。對(duì)葉綠素a含量為1．0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了11次平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．48%。

2．5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的可靠性，課題組對(duì)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的小球藻提取液樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加濃度為0．5mg/L的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)溶液到樣品中，平行三次，測(cè)得回收率在97．0% ～104%之間，結(jié)果說(shuō)明，建立的方法對(duì)小球藻中葉綠素a的測(cè)定準(zhǔn)確度能夠滿足測(cè)定要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中葉綠素a回收率的測(cè)定結(jié)果

2．6 同步熒光法與分光光度法測(cè)定結(jié)果的比較

對(duì)4份小球藻萃取液樣品分別采用國(guó)家環(huán)保總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》推薦的分光光度法和同步熒光法進(jìn)行葉綠素a的重復(fù)測(cè)定，結(jié)果列于表2，由數(shù)據(jù)對(duì)比可以看出同步熒光法與分光光度法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，但該方法具有快速、靈敏，其他常見(jiàn)色素不干擾測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。

表2 分別采用分光光度法及同步熒光法獲得的小球藻提取液中葉綠素a濃度

3 結(jié)論

綠藻色素成分復(fù)雜，采用超聲波提?。綗晒鈾z測(cè)法測(cè)定綠藻中的葉綠素a，節(jié)省了操作步驟，提高了葉綠素提取效率，避免了散射干擾，方法選擇性和靈敏度高，檢出限達(dá)到1．6ug/L，而且具有簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)，能夠滿足供水快速檢測(cè)的需要。

(編輯:溫武軍)

［1］呂洪剛，張錫輝，鄭振華，歐陽(yáng)二明．原水藻與葉綠素a定量關(guān)系的研究［J］．給水排水，2005，31(2):26－29．

［2］高洪峰，焦念志．通過(guò)藻類色素分析估測(cè)海洋浮游植物生物量和群落組成的研究進(jìn)展［J］．海洋科學(xué)，1997(3):51－53．

［3］Patra D，Mishra A K．Recent Developments in Multi-component Synchronous Fluorescence Scan Analysis［J］．Journal of Scientific and Industrial Research，2002，21(12):787 －798．

［4］黃賢智，許金鉤，蔡挺．同步熒光分析法同時(shí)測(cè)定葉綠素a和葉綠素 b［J］．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1987，8(5):418 －420．

［5］唐堯基，游文瑋，陳瑩，李耀群．同步熒光法測(cè)定海水中葉綠素a的含量［J］．分析儀器．2004，(3):24－26．