正常人腸道不同乳酸桿菌菌種耐藥性的研究

熊鹿言，唐海豐，余 倩

(1.上海市普陀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200333；2.四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室，四川 成都 610041)

乳酸桿菌(Lactobacillus)是人體腸道常見的益生菌之一，能幫助改善、調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群的平衡，降低膽固醇水平。目前，從國內(nèi)外對其在分子生物學(xué)水平的研究的情況來看，乳酸桿菌的質(zhì)粒上攜帶著多種耐藥基因，使其與臨床常見致病菌一樣，成為一個耐藥基因庫。部分學(xué)者認(rèn)為乳酸桿菌具有耐藥性是有利的，這個性質(zhì)可以避免這些對人體有益的乳酸桿菌在人們利用抗生素治療疾病的時候被一并殺滅掉。但是，這也意味著存在將這種耐藥性傳遞給外源致病菌的巨大風(fēng)險，這將對臨床用藥帶來巨大的挑戰(zhàn)。本研究對不同種的乳酸桿菌進(jìn)行耐藥譜及質(zhì)粒譜層面的分析，評估人體腸道乳酸桿菌常見菌種的耐藥性，為疾病的治療提供新的思路，豐富臨床用藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213）由四川大學(xué)華西醫(yī)院惠贈；乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（嗜酸乳酸桿菌ATCC4356）V517）由四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室保存；乳酸桿菌試驗(yàn)菌株、經(jīng)鑒定的正常人腸道糞便分離株，共43株，由四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室保存。

1.1.2 試劑

1.1.2.1 培養(yǎng)基及試劑 MRS液體/固體培養(yǎng)基（按照《保健食品與評價技術(shù)規(guī)范》自配）；改良MRS液體/固體培養(yǎng)基（在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨和硫酸鎂含量減半，去掉吐溫80和乙酸鈉）；SDS-MRS液體培養(yǎng)基（在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.015%的SDS）；5倍TBE溶液；質(zhì)粒提取試劑盒，購于Omega公司。

1.1.2.2 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品 八大類12種（見表1），購于中國藥品生物制品檢定所，參照文獻(xiàn)配制[1]，抗生素原液濃度為1 280 μg/ml。苯唑西林紙片購于北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2.3 糖標(biāo)準(zhǔn)品 扁桃甙、阿拉伯糖，纖維二糖，果糖，半乳糖，葡萄糖，葡萄糖酸鹽，乳糖，麥芽糖，甘露醇，甘露糖，松三糖，蜜二糖，棉子糖，鼠李糖，核糖，柳醇，山梨醇，蔗糖，海藻糖，木糖，七葉苷，共22種，購于北京路橋技術(shù)有限公司。參見文獻(xiàn)配制糖發(fā)酵管[2-3]。

表1 43株乳酸桿菌耐藥情況（株）

1.2 方法

1.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)(微量法)將乳酸桿菌從肉湯轉(zhuǎn)入MRS平板中，37℃微需氧培養(yǎng)24 h。將配制好的糖發(fā)酵試劑加入96孔板，200 μl/孔，用接種針從MRS平板上挑取適量的菌接種每孔中。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后[3]觀察結(jié)果。以嗜酸乳酸桿菌ATCC4356為質(zhì)控菌，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版及《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 微量肉湯稀釋法[1]乳酸桿菌接種MRS肉湯，37℃微需氧增菌18～20 h。參照參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行試驗(yàn)。菌液濃度調(diào)至5×105cfu/ml，使用改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213為質(zhì)控，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏試驗(yàn)MIC結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.2.2 K-B紙片法[1，4]乳酸桿菌接種MRS肉湯，37°C微需氧增菌18～20 h。菌液濃度調(diào)至5×105cfu/ml，使用改良MRS平板及苯唑西林藥片[5]。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后，以標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923作為質(zhì)控菌株，參考CLSI推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏抑菌環(huán)直徑標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.3 質(zhì)粒測定

1.2.3.1 質(zhì)粒的提取 乳酸桿菌接種MRS肉湯，37℃220 r/min微需氧振蕩培養(yǎng)16～18 h。取5 ml菌液，高速離心后，棄上清液，加入25 mg溶菌酶，用緩沖液重懸菌體并使其與酶混勻，37℃水浴1 h。余下操作參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書。

1.2.3.2 質(zhì)粒的測定 取10 μl質(zhì)粒提取物加入制好的0.5%瓊脂糖凝膠板中，7.5 V/cm電泳2 h，用UVI凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli V517的質(zhì)粒提取物為參考，判定質(zhì)粒大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用秩和檢驗(yàn)對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定 經(jīng)37℃微需氧培養(yǎng)，質(zhì)控菌ATCC4356糖發(fā)酵結(jié)果與嗜酸乳酸桿菌結(jié)果符合。在所測43株試驗(yàn)菌中共檢出6個菌種，含量最多的為植物乳酸桿菌L.plantarum(n=21，51.17%)，其次是干酪乳酸桿菌L.casei(n=9，20.93%)、嗜酸乳酸桿菌L.acidophilus(n=7，16.28%)和唾液乳酸桿菌L.salivarius(n=3，6.98%)，同時還檢出目前正常人腸道乳酸桿菌中尚未報(bào)道的乳酸乳桿菌L.lactis(n=2，4.65%)，賴氏乳酸桿菌L.leichmannii(n=1，2.32%)。

2.2 耐藥情況 L.casei、L.plantarum、L.salivarius和L.acidophilus是人體腸道內(nèi)常見的菌種。本文對被鑒定為上述四種菌種的乳酸桿菌進(jìn)行了藥敏分析，共43株，其耐藥情況見表1、表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)秩和檢驗(yàn)，四種菌對慶大霉素（χ2=8.773，P＜0.05）、四環(huán)素（χ2=14.659，P＜0.05）、頭孢呋辛(χ2=11.262，P＜0.05）、頭孢唑啉(χ2=13.810，P＜0.05）、利福平(χ2=12.030，P＜0.05）、羅紅霉素(χ2=12.727，P＜0.05）及紅霉素(χ2=17.886，P＜0.05)的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對環(huán)丙沙星(χ2=0，P＞0.05）、左氟沙星(χ2=0，P＞0.05）、萬古霉素（χ2=0，P＞0.05）、青霉素(χ2=0，P＞0.05）、氨芐西林(χ2=0，P＞0.05)及苯唑西林(χ2=4.895，P＞0.05)的耐藥性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 質(zhì)粒檢出情況 43株乳酸桿菌中有40株檢出質(zhì)粒，檢出率為93%。其余菌株帶有1～6個質(zhì)粒，檢出率分別為4.65%、32.56%、20.93%、4.65%、13.95%、16.26%。共檢出20種不同大小的質(zhì)粒，其分子量范圍為1.9～85 kb，而大多數(shù)質(zhì)粒小于20 kb，具體檢出情況見表3。常見的質(zhì)粒分子量大小是54.0 kb、41.0 kb、22.0 kb和 5.8 kb，檢出率分別為60.5%、37.2%、37.2%、48.8%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)秩和檢驗(yàn)推斷，不同乳酸桿菌種的質(zhì)粒譜的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.277，P＞0.05)。

表2 43株乳酸桿菌藥敏紙片法結(jié)果（株）

表3 乳酸桿菌質(zhì)粒檢出情況

3 討 論

3.1 菌種 根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊以及其他相關(guān)報(bào)道可知，乳酸乳桿菌存在于牛奶、干酪和用于制造干酪的引子中，而賴氏乳酸桿菌多存在于壓縮酵母、谷物麥芽汁中[5]，二者并不屬于正常人腸道內(nèi)常見的菌種。這是否由于納入對象在受試前食用了含有乳酸乳桿菌和賴氏乳酸桿菌的食品所造成的，還需進(jìn)一步進(jìn)行確定。

3.2 種間的耐藥分析 本文旨在探尋乳酸桿菌種間水平的耐藥譜及質(zhì)粒譜的研究，為最終乳酸桿菌耐藥性判讀標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)。由于目前未見關(guān)于乳酸桿菌藥敏結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)參考的是CLSI推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏標(biāo)準(zhǔn)，從表型水平、質(zhì)粒水平以及菌種水平去分析乳酸桿菌的耐藥性，豐富了關(guān)于乳桿菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。目前，從菌種水平去研究乳酸桿菌耐藥性的主要菌種都來自于食品、動物及微生物制劑。Maria Rosaria D'Aimmo等[16]對從奶制品等中分離出的6株L.acidophilus及6株L.casei進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳桿菌的兩個菌種對氨芐西林、紅霉素、青霉素、利福平都是敏感的，而對頭孢噻酚、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素的耐藥性與菌種相關(guān)[16]。其中萬古霉素的結(jié)果與本研究有所差異，這種差異可能是由于菌種來源不同所造成的，其他結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)是一致的。在各種來自與食品及微生物制劑的L.plantarum耐藥性的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其對與氯霉素（耐藥率為3%）、氨芐西林（47.5%）、氯唑西林（80%）、青霉素（77.5%）、紅霉素（16%）、四環(huán)素（100%）[6-10]存在著不同程度的耐藥性。除紅霉素與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致外，青霉素、氨芐西林存在著較大的差異。Cauwerts等[11]對來自家禽雞腸道的乳酸桿菌進(jìn)行的種間水平的耐藥分析，發(fā)現(xiàn)L.salivarius帶有耐四環(huán)素(耐藥率75%)的tet（M）基因，50%的菌株帶有耐紅霉素(耐藥率 81%)的 erm(B)[12]。Marisa 等[13]曾專門針對 L.acidophilus進(jìn)行耐藥研究，發(fā)現(xiàn)其對于氨基糖苷類全耐受，對氨芐西林、氯霉素、利福平敏感、鄰氯青霉素50%敏感，四環(huán)素、紅霉素類基本耐受，對萬古霉素大部分耐受。后來Milazzo等[14]的研究再次證實(shí)L.acidophilus對氨基糖苷類抗生素全耐受。本研究結(jié)果與這些文獻(xiàn)相符，正常人腸道常見的四種菌種對萬古霉素都是耐受的。所以萬古霉素治療金黃色葡萄球菌（MRSA）感染等疾病時，不影響乳酸桿菌菌群。然而，如果乳酸桿菌成為條件致病菌發(fā)生異位，萬古霉素并不能成為抗菌藥物的最后防線，這將對臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。

3.3 耐藥質(zhì)粒 據(jù)報(bào)道，大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒均為隱蔽性質(zhì)粒，其功能無法獲知。本次實(shí)驗(yàn)中雖從大多數(shù)細(xì)菌檢出質(zhì)粒，但并沒有得出質(zhì)粒譜和耐藥譜之間、質(zhì)粒譜與菌種之間的確切聯(lián)系。耐藥譜相同的菌株可能攜帶有不同數(shù)量和大小的質(zhì)粒，而質(zhì)粒圖譜相同的菌株耐藥譜可能相差很大，這證實(shí)了乳酸桿菌的耐藥性除與質(zhì)粒相關(guān)外，還與細(xì)菌的表型、環(huán)境以及來源等有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中檢出乳酸桿菌含有21種不同大小的質(zhì)粒，范圍在1.9～83 kb之間,而大多數(shù)質(zhì)粒小于20 kb。根據(jù)目前文獻(xiàn)資料，Geert等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物乳酸桿菌中分子量為14 kb的質(zhì)粒與四環(huán)素的耐藥性有關(guān)，而在本次研究中并未檢測出14 kb的質(zhì)粒，推斷可能四環(huán)素的耐藥與其他大小的質(zhì)粒同樣有關(guān)系。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒大小在1.2～150 kb之間，絕大多數(shù)質(zhì)粒小于20.0 kb，且數(shù)量各異，本次研究與以上報(bào)道的結(jié)果相符。

[1]倪語星,王金良,徐英春.抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)規(guī)范[M].上海：科學(xué)技術(shù)出版社,2002：22,24,26,78-80.

[2]王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：897-898.

[3]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.35-2008.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸桿菌飲料中乳酸桿菌檢驗(yàn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[4]倪語星,洪秀華.細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與抗感染治療[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2002：48-50,54-55.

[5]R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰細(xì)菌學(xué)手冊（第8版）[M].北京：科學(xué)出版社,1984：797-822.

[6]Ahn C,Collins-Thompson D.Mobilization and location of the genetic determinant of chloramphenicol resistance from Lactobacillus plantarum caTC2R[J].Plasmid,1992,27：169-176.

[7]Vidal CA,Collins-Thompson D.Resistance and sensitivity of meat lactic acid bacteria to antibiotics[J].Food Prot,1987(50)：737-740.

[8]Olukoya DK,Ebigwei SI.Plasmid profiles and antibiotic susceptibility patterns of Lactobacillus isolated from fermented foods in Nigeria[J].Food Microbiol,1993,10：279-285.

[9]Temmerman R,Pot B,Huys G.Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products[J].Food Microbiol,2002,81：1-10.

[10]Danielsen M.Characterization of the tetracycline resistance plasmid pMD5057 from Lactobacillus plantarum 5057 reveals a composite structure[J].Plasmid 2002,48：98-103.

[11]Cauwerts K,Pasmans F.Cloacal Lactobacillus Isolates from Broilers Often DisplayResistance Toward Tetracycline Antibiotics[J].MICrobial Drug Resistance,2006,12(4)：284-288.

[12]Cauwerts K,Pasmans F.Cloacal Lactobacillus isolates from broilers show high prevalence of resistance towards macrolide and lincosamide antibiotics[J].Avian Pathology,2006,35(2)：160-164.

[13]Vescovo M,Morelli L,Bottazzi V,et al.Drug Resistance Plasmids in Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus reuteri[J].Applied And Environmental Microbiologyy,1982,1143(1)：50-56.

[14]Milazzo I,Speciale A.Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products available in Italy[J].New Microbiol,2006,29(4)：281-291.

[15]Wang TT,Lee BH.Plasmids in Lactobacillus[J].Crit Rev Biotechnol,1997,17：227-272.

[16]D'Aimmo MR,Modesto M,Biavati B.Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp.isolated from dairy and pharmaceutical products[J].International Journal of Food Microbiology,2007,115：35-42.

[17]Huys G,D'Haene K,Swings J.Genetic Basis of Tetracycline and Minocycline Resistance in Potentially Probiotic Lactobacillus plantarum Strain CCUG 43738[J].Antikmicrobial Agents And Chemotherapy,2006,50(4)：1550-1551.