HPLCELSD法測定硫酸西索米星有關(guān)物質(zhì)的研究*

劉海玲，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

硫酸西索米星是由小單孢菌所產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，由于氨基糖苷類抗生素?zé)o特征紫外吸收，不能直接采用傳統(tǒng)HPLC-UV法測定，采用衍生化方法測定試驗結(jié)果影響因素多，無法明確判斷檢測到的雜質(zhì)來源，限制了衍生化法在氨基糖苷類抗生素有關(guān)物質(zhì)檢測方面的應(yīng)用。蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)為不含發(fā)色團(tuán)化合物的分析提供了一種新的檢測手段，其響應(yīng)值與被測物質(zhì)量成正比，不依賴于被測物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)[1]。近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報道用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量分析[2-5]?！度站址健返?5改正版采用TLC法檢查硫酸西索米星有關(guān)物質(zhì)，其余各國藥典均未制定硫酸西索米星有關(guān)物質(zhì)檢查項。本實驗采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法[6]對硫酸西索米星進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，方法靈敏度高、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好，可滿足質(zhì)量控制要求。

1 儀器與試藥

島津LC-10AT高效液相色譜儀，Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器。西索米星標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號0353-200001)；硫酸西索米星為江蘇無錫山禾福祁制藥有限公司(批號20070801、20071001和20071002)和江蘇無錫第二制藥廠(批號20070503)提供。試驗用水為娃哈哈飲用純凈水；三氟乙酸為TEDIA公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：CAPCELL PAK TYPE：ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：0.3 mol/L三氟乙酸-甲醇-乙腈(96∶3∶1)；流速：0.5 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度：110 ℃，霧化氣體流速：3.0 L/min。

系統(tǒng)適用性試驗：分別稱取慶大霉素C1a和西索米星對照品適量，用水溶解并稀釋制成每1 ml中含慶大霉素C1a0.1 mg和西索米星3 mg的溶液，作為分離度測試溶液①；稱取西索米星對照品約50 mg，加0.5 ml過氧化氫溶液(濃過氧化氫溶液10→100)溶解，水浴45 min后立即取出，放冷至室溫，加水稀釋至10 ml，搖勻，作為分離度測試溶液②。分別精密量取分離度測試溶液①和②各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。西索米星峰與慶大霉素C1a峰的分離度為1.2；在相對保留時間0.80～0.95處應(yīng)能檢測出三個氧化降解物。見圖1。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液 取本品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星3 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2自身對照溶液 精密量取供試品溶液適量，加水稀釋制成每1 ml中約含西索米星15、30和120 μg的溶液，作為自身對照溶液①、②和③。

2.3破壞試驗 取硫酸西索米星適量，進(jìn)行①酸(50%三氟乙酸溶液1 ml,水浴5 min)、②堿(濃氨溶液0.5 ml,水浴1 h)、③氧化(10%過氧化氫溶液0.5 ml，水浴45 min)，分別用水稀釋制成每1 ml中含3 mg的溶液，④熱(水溶液，水浴1 h)和⑤紫外光(254 nm)(水溶液，照射24 h)破壞，進(jìn)樣測定，色譜圖見圖2。各破壞條件下，降解產(chǎn)物峰均能與西索米星峰良好分離。破壞試驗表明，本法可有效檢出分解產(chǎn)物。

1.西索米星 2.慶大霉素C1a 3.三個氧化降解物

2.4穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液室溫分別放置0、4和8 h時測定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果表明硫酸西索米星供試品溶液室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，總雜質(zhì)分別為3.32%、3.30%和3.28%，最大單一雜質(zhì)分別為2.01%、2.02%和2.01%。

2.5線性試驗和最低檢出量 取西索米星對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含西索米星1 mg的溶液，精密量取此溶液0.75、1.5、3.0、6.0和12.0 ml，分別置5個100 ml量瓶中，均加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取各溶液20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。硫酸西索米星進(jìn)樣量(以西索米星計算)在0.15～2.38 μg范圍內(nèi)，峰面積對數(shù)(Y)與進(jìn)樣量對數(shù)(X)線性相關(guān)：Y=1.725 0X+5.954 2(r=0.999 8)。以信噪比3為限，在此色譜條件下，西索米星有關(guān)物質(zhì)檢查最低檢出量為57 ng。

1.西索米星

2.6有關(guān)物質(zhì)的測定 按照“2.2”項下的方法制備供試品及自身對照溶液，在“2.1”項下色譜條件下，精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。以自身對照溶液濃度的對數(shù)值與相應(yīng)峰面積的對數(shù)值計算回歸方程，用回歸方程計算單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1流動相的選擇 氨基糖苷類抗生素極性較大，在ODS柱上不保留，可通過與揮發(fā)性酸形成離子對或采用堿性流動相使氨基糖苷類抗生素游離成堿，降低極性以增加在色譜柱上的保留[3]。

采用堿性條件[4]，試驗了乙酸胺系統(tǒng)，試驗結(jié)果表明，流動相為堿性時，雜質(zhì)峰分離度不好，西索米星色譜峰峰形不對稱。

采用酸性條件，試驗了五氟丙酸系統(tǒng)[5]，試驗結(jié)果表明，隨著五氟丙酸濃度的增大，主峰前的雜質(zhì)峰與主峰的分離度變大，但出峰時間較晚，主峰峰形不對稱。試驗了三氟乙酸流動相系統(tǒng)[3]，隨著流動相中三氟乙酸濃度的增加，西索米星色譜峰的保留時間減少，峰形改善，檢出雜質(zhì)也相應(yīng)的增加。在流動相中添加丙酮和四氫呋喃，雜質(zhì)峰均未分離；添加乙腈和甲醇，各雜質(zhì)峰的分離較好。將流動相中的有機(jī)相改為甲醇和乙腈的混合溶液，保證了色譜峰的峰形和分離度，增加了流動相中有機(jī)相的比例，結(jié)果較為滿意。因此選擇三氟乙酸作為流動相的離子對試劑對西索米星進(jìn)行分析。

3.2蒸發(fā)光散射檢測器條件的選擇 考察漂移管溫度分別為80、100、105、110和115 ℃時的分析情況，試驗結(jié)果表明，漂移管的溫度對檢測結(jié)果影響不顯著。分別考察載氣流速為2.0、2.5 、3.0 和3.5 L/min 時的分析情況，試驗結(jié)果表明隨著載氣流速的減小，峰面積增大，基線則越不穩(wěn)定。綜合試驗結(jié)果，確定漂移管溫度為110 ℃，載氣流速為3.0 L/min。

3.3本試驗中根據(jù)保留時間一致，暫稱西索米星主峰后緊鄰的雜質(zhì)為慶大霉素C1a，并未進(jìn)行其他確證試驗。

3.4色譜柱的粗放度 采用Diamonsil C18100 A(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和CAPCELL PAK TYPE:ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱不同時間測定20070503批樣品，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，檢測結(jié)果基本一致。

表2 采用不同色譜柱測定結(jié)果的比較

本方法采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器檢測，樣品不需要衍生化，可避免測定過程引入新的雜質(zhì)，提高了分析精度，相較于傳統(tǒng)薄層色譜法有更高的靈敏度及準(zhǔn)確性，可以提高產(chǎn)品的質(zhì)控水平，增加藥品使用安全性。

1 陳冠華，潘淑萍，胡江寧.硫酸阿米卡星含量及有關(guān)物質(zhì)的HPLC-ELSD測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(3)：171

2 吳燕，張勝強(qiáng)，郭成明，等.HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星與硫酸西索米星的含量和有關(guān)物質(zhì).中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2004，5(4)：35

3 王建, 王知堅, 陳貴斌, 等.HPLC-ELSD和HPLC-MSn分析硫酸西索米星及其注射液.中國藥學(xué)雜志，2007，42(1): 62

4 Wang Mingjuan, Hu Changqin.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative light-scattering detection.Chromatographia,2006,63(5/6):255

5 Megoulas N C,Koupparis M A.Development and validation of novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals,plasma,and urine.Anal Bioanal Chem,2005,382(2):290

6 劉海玲，曹曉云. HPLC-ELSD法測定硫酸西索米星的含量.天津藥學(xué)，2011，23(4)：3