高效液相蒸發(fā)光散射色譜法測定鹽酸氨基葡萄糖片有關(guān)物質(zhì)的研究*

訾晨瑞，石秀偉，郝宏山

(天津市軒宏醫(yī)藥技術(shù)有限公司，天津 300192)

氨基葡萄糖(GS)是一種天然的氨基單糖，是軟骨基質(zhì)和滑液中聚氨基葡萄糖的成分，是治療骨性關(guān)節(jié)炎的特異性藥物。氨基葡萄糖在體外一般以硫酸、鹽酸、N-乙?；锏男问酱嬖冢鼈冊谖杆嶂型耆怆x，在小腸中以氨基葡萄糖的原形吸收，一旦被吸收就與最初的酸根無關(guān)[1]。

鹽酸氨基葡萄糖由于價格較低廉，近年來得到廣泛應(yīng)用，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS1-SG-028-2001)和USP也有收載。但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均未制訂有關(guān)物質(zhì)檢查項。USP30版收載質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用HPLC方法在195 nm處測定含量。鹽酸氨基葡萄糖屬于小分子多羥基化合物，該類型化合物一般極性較強(qiáng)，由于其結(jié)構(gòu)中含有氨基，極可能與檢測池壁產(chǎn)生相互作用，伴隨吸附與解吸附的進(jìn)程，影響到光路而產(chǎn)生負(fù)峰[2]。同時由于在紫外區(qū)缺乏特征吸收或者僅有微弱的末端吸收，以200nm以下的極限末端吸收波長為檢測手段時，易放大溶劑、鹽基(無機(jī)離子)和共存物質(zhì)的干擾響應(yīng)，實驗偏差較大。為此，考慮到鹽酸氨基葡萄糖的強(qiáng)極性及弱紫外吸收的特性，采用質(zhì)量型的蒸發(fā)光散射檢測技術(shù)(HPLC-ELSD)檢測鹽酸氨基葡萄糖片的有關(guān)物質(zhì)。ELSD最大的優(yōu)勢在于它可以檢測無特征紫外吸收的物質(zhì)，采用HPLC-ELSD檢測技術(shù)對鹽酸氨基葡萄糖片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，并建立準(zhǔn)確、靈敏、快捷的分析方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Lab Alliance Series III型高效液相色譜儀；檢測器：Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器；氣源：WYK-2型無音無油空壓機(jī)；工作站：Anastar色譜工作站。

1.2試藥 鹽酸氨基葡萄糖片(廠家A：深圳資福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號100601、101001、101002，規(guī)格：240 mg/片)；鹽酸氨基葡萄糖片(廠家B：四川寶光藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號100502)。三氟乙酸(TFA)、乙腈均為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性 液相色譜柱：Applied Biosystems BrownleeTMColumns，SPHERI-5 CYANO，(220 mm ×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈-0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液(70∶30)；柱溫：30 ℃；流速：0.4 ml/min；Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度85 ℃，Gain=1，Impactor=off；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖片的細(xì)粉適量，加流動相適量，超聲使溶解，配制成濃度約為0.3 mg/ml(以鹽酸氨基葡萄糖計)的樣品溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2自身對照溶液 精密量取上述供試品溶液1.0 ml，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為2%自身對照溶液。

2.2.3空白輔料溶液 精密稱取空白輔料適量，配制成約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖0.3 mg/ml的空白輔料溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

取供試品溶液和空白輔料溶液各20 μl,依“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，鹽酸氨基葡萄糖主峰與輔料峰分離度為5.810，大于1.5，與其他雜質(zhì)峰分離度也大于1.5，輔料峰與1#雜質(zhì)峰分離度為2.152，大于1.5，分離度良好。見圖1。

2.3破壞試驗 分別稱取空白輔料、鹽酸氨基葡萄糖片粉適量，分別加入流動相適量，超聲使溶解，用強(qiáng)光照射(4500 LX)12 h以上；分別加入流動相、強(qiáng)酸(0.1 mol/L鹽酸)、強(qiáng)堿(0.1 mol/L氫氧化鈉)、雙氧水溶液(30%過氧化氫)適量，超聲使溶解，沸水浴加熱2 h以上，冷卻至室溫后用流動相稀釋至刻度，制成濃度約為0.3 mg/ml(以鹽酸氨基葡萄糖計)的樣品溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，分別進(jìn)行測試，記錄色譜圖。同時與未經(jīng)破壞的空白輔料及制劑樣品進(jìn)行比較，用以考察可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑。結(jié)果表明，光、熱破壞實驗對空白輔料沒有破壞作用，對制劑均使其雜質(zhì)稍有增大；酸堿環(huán)境對空白輔料及制劑均有較強(qiáng)的破壞作用；氧化環(huán)境對空白輔料及制劑均有一定的破壞作用。各破壞條件下，降解產(chǎn)物峰均能與鹽酸氨基葡萄糖峰良好分離，見圖1。

2.4重復(fù)性試驗 按照“2.2.1”和“2.2.2”項下的方法分別制備6份供試品和自身對照溶液，分別精密量取續(xù)濾液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以樣品溶液峰面積的lg值與稱樣量lg值的比值計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD分別為0.71%和1.00%。結(jié)果表明，供試品溶液及自身對照溶液重復(fù)性良好。

1．鹽酸氨基葡萄糖

2.5穩(wěn)定性試驗 分別以重復(fù)性試驗中供試品溶液及自身對照溶液的1#樣品為穩(wěn)定性0 h樣品，分別在室溫自然光下放置1、2和4 h后，精密量取各溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果：供試品溶液及2%對照溶液室溫放置4 h，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.92%和1.94%，穩(wěn)定性良好。

2.6線性試驗 取鹽酸氨基葡萄糖片粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖25 mg)，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，用濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液線性試驗貯備液，備用。精密量取此液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 ml分別置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取各溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以溶液濃度的對數(shù)值和主峰面積的對數(shù)值計算線性回歸方程，得線性方程：Y=1.235 6X+8.139 0(R2=0.999 4)。精密量取供試品溶液線性實驗貯備液1.0 ml，置于50 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液線性實驗貯備液，備用。精密量取此液2.0、5.0、6.0、8.0分別置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以溶液濃度的對數(shù)值和主峰面積的對數(shù)值計算線性回歸方程，得線性方程：Y=0.670 1X+ 6.983 2(R2=0.990 4)。線性試驗結(jié)果表明，供試品溶液濃度在0.050 1～0.400 8 mg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。自身對照溶液濃度在0.002 004～0.010 02 mg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。同時，當(dāng)溶液濃度為0.002 004 mg/ml時，主峰的峰高約為基線噪聲的3倍，即為供試品溶液雜質(zhì)的最低檢出限，最低檢出量約為40 ng。

2.7有關(guān)物質(zhì)的測定 按照“2.2”項下的方法制備供試品及自身對照溶液，在“2.1”項色譜條件下，精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2.5倍。供試品溶液色譜圖中，如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰峰面積之和不得大于對照溶液主峰面積。樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果表明，不同廠家各批號樣品有關(guān)物質(zhì)均小于2.0%。結(jié)果見表1和圖2。

1.鹽酸氨基葡萄糖

表1 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1色譜柱選擇 考慮到鹽酸氨基葡萄糖屬于小分子多羥基化合物，易溶于水，極性較大，在普通C18色譜柱上難以保留，而正相HPLC系統(tǒng)則會由于采用低極性溶劑作為流動相而存在溶解性方面的問題。因此，選用氰基柱，由于氰基柱和C18柱同樣可用于非極性、弱極性和中等極性化合物分析，在反相模式下，其保留性弱于C18，但對強(qiáng)極性化合物的保留性強(qiáng)于C18柱(C18柱基本不保留強(qiáng)極性化合物)。

3.2流動相選擇 分別考察了相同樣品濃度在不同比例(50%、70%、90%乙腈水溶液)流動相條件下的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)流動相中水的比例較大時，分析時間較短，但不利于流動相在漂移管內(nèi)汽化，使基線噪聲增大，從而導(dǎo)致分析靈敏度減低。另外，水的比例增大，為了使流動相在漂移管內(nèi)汽化良好，則必須提高漂移管溫度，這樣有可能造成分析樣品部分揮發(fā)，導(dǎo)致顆粒量下降而使檢測器響應(yīng)下降。乙腈在流動相比例中增大可有效改善色譜峰形，有利于各組分的基線分離，但乙腈比例增加不利于鹽酸氨基葡萄糖的溶解，分析時間也顯著延長。綜合考慮不同流動相比例下的分離效果、分析時間等因素，選擇乙腈-水(70∶30)系統(tǒng)作為流動相。并在此基礎(chǔ)上調(diào)整其他實驗條件，以得到最優(yōu)化的色譜系統(tǒng)。

3.3儀器條件 本法采用了較高比例的乙腈水溶液(70∶30)作為流動相，溶劑較易揮發(fā)，故漂移管溫度參考Alltech ELSD 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測器所使用軟件ELSD 2000 Control(Version1.5.302.0)的推薦檢測條件：漂移管溫度83.5 ℃，氣體流速2.2 L/min，Gain=1，Impactor=off。并做如下調(diào)整：為了使流動相得到更加充分的汽化，將漂移管溫度適當(dāng)調(diào)高至85 ℃。同時，由于過快的氣體流速也會使微粒量下降而導(dǎo)致信號響應(yīng)降低，因此適當(dāng)降低氣體流速至2.0 L/min，Gain值及Impactor狀態(tài)保持不變。

3.4其他 在上述色譜條件的基礎(chǔ)上，以達(dá)到較好的分離度及相對較高的靈敏度為原則，同時兼顧分析時間等因素進(jìn)一步調(diào)整檢測條件。根據(jù)試驗結(jié)果，乙腈與0.1%TFA水溶液組成的流動相系統(tǒng)使出峰順序發(fā)生了改變，同時使鹽酸氨基葡萄糖峰響應(yīng)值顯著增大，并有較好的分離度及柱效。另外，較快的流動相流速使得空白輔料峰與雜質(zhì)峰發(fā)生重疊，造成對雜質(zhì)檢出的干擾。此外，柱溫的升高在分離效果上沒有本質(zhì)的差別，因此選擇比較常規(guī)的30 ℃作為柱溫。綜上所述，最終確定“2.1”項的色譜條件。

現(xiàn)行的國內(nèi)外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，有關(guān)物質(zhì)的檢查方法并沒有收錄在內(nèi)，但有關(guān)物質(zhì)檢查項已經(jīng)日益成為口服制劑的重要檢查項目，而HPLC-ELSD有關(guān)物質(zhì)檢查方法的使用，相較于傳統(tǒng)薄層色譜法有更高的靈敏度及準(zhǔn)確性，可以提高產(chǎn)品的質(zhì)控水平，增加藥品使用安全性。根據(jù)方法學(xué)各項研究試驗結(jié)果及不同廠家生產(chǎn)的鹽酸氨基葡萄糖片有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果，本文中建立的HPLC-ELSD法檢測鹽酸氨基葡萄糖片中有關(guān)物質(zhì)的限度為2.0%。

1 羅娟,胡永善,吳毅,等.鹽酸氨基葡萄糖改善膝骨性關(guān)節(jié)炎癥狀的效果評估.中國臨床康復(fù),2005,9(38):70

2 李海生,白海嬌.高效液相色譜應(yīng)用中的若干問題與解決方法.天津藥學(xué),2006,18(2):5