反相高效液相色譜法同時檢測肉湯培養(yǎng)基(CM129)中左氧氟沙星和阿奇霉素的藥物濃度*

運乃茹，何志強

(1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150; 2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，太原 030001)

阿奇霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，前期實驗中，發(fā)現(xiàn)阿奇霉素能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成。氨溴索可以在銅綠假單胞菌形成的生物膜表面打孔，促進環(huán)丙沙星透過生物膜，為研究阿奇霉素對于成熟的生物膜是否存在類似氨溴索的作用，建立了一種檢測CM129培養(yǎng)液中阿奇霉素與左氧氟沙星濃度的方法，用于檢測左氧氟沙星與阿奇霉素合用的透過量。

1 儀器與試藥品

1.1儀器 高效液相色譜儀：島津LC-10A，LC-10AD紫外檢測器，浙大N2000工作站，Waters反相C18柱(3.9 mm×150 mm)。pH計：上海雷磁PHSJ-4A型。分析天平：湘儀TG328B。磁力攪拌器：上海凱欣儀器廠85-2型。超聲儀：上海BRANSON廠SB3200，隔膜真空泵：天津市南開區(qū)騰達過濾器件廠GM-0.15型。渦旋振蕩器：BLENDER的ZH-2型。低速離心機：上海手術器械廠80-2型。

1.2試藥 阿奇霉素和左氧氟沙星對照品(純度>99%)購自中國藥品和生物制品檢定所，西司他丁鈉對照品(純度97.8%)由山西省藥檢所提供。甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷為色譜純購自天津四友化學試劑廠。磷酸二氫鉀及磷酸購自天津市化學試劑三廠，CM129培養(yǎng)基粉末購自Oxoid公司。

2 方法

2.1色譜條件 分析柱為Waters公司反相C18柱，流動相為甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(29∶71，pH 2.53)，流速為1 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為210 nm，進樣量為10 μl。左氧氟沙星保留時間為3.650 min，阿奇霉素保留時間為4.425 min，西司他丁鈉做為內(nèi)標，保留時間為6.874 min。在空白培養(yǎng)液中加入以上三種標準對照品，處理后進樣，色譜圖見圖1。

1.左氧氟沙星 2.阿奇霉素 3.西司他丁鈉

2.2樣品的制備與處理 培養(yǎng)銅綠假單胞菌，使之附著于微孔濾膜(0.22 μm)上形成生物膜，分別于生物膜剛形成及形成后的5 d(銀染觀察生物膜是否形成)向此裝置中加入左氧氟沙星與阿奇霉素，使之自由透過生物膜，透過生物膜后的培養(yǎng)液為待測樣品，每種樣本平行做3次。

取0.5 ml樣品至離心管內(nèi)，加入乙腈0.5 ml和異丙醇0.5 ml，渦旋振蕩5 min，放入低速離心機以4 000 r/min速度離心10 min，棄沉淀，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入1 ml二氯甲烷，渦旋振蕩5 min，放入低速離心機以4 000 r/min速度離心10 min，取出后靜置1 min，分層，取上清液，轉(zhuǎn)移至EP管中，取10 μl進樣。試驗參照文獻[1-2]方法進行改進。

2.3標準曲線的制備 精密稱取阿奇霉素及左氧氟沙星對照品各32 mg , 用蒸餾水分別定容于10 ml 的量瓶中, 分別使之成3.2 mg/ml的標準對照液，取西司他丁鈉對照品10 mg，用蒸餾水定容至10 ml量瓶中，使之成為1 mg/ml的標準對照液。取五支試管，第一管加入1.2 ml CM 129培養(yǎng)液，加入0.4 ml的阿奇霉素標準對照液及0.4 ml左氧氟沙星標準對照液，其余四管分別加入1 ml的培養(yǎng)液。使用倍比稀釋法稀釋溶液，每管內(nèi)加入50 μg/ml西司他丁鈉1 ml。配制培養(yǎng)液中分別含左氧氟沙星、阿奇霉素濃度依次為160、80、40、20和10 μg/ml，西司他丁鈉為25 μg/ml。阿奇霉素測得吸收峰響應值高度與西司他丁鈉測得測得吸收峰響應值高度比值對阿奇霉素濃度進行線性回歸，回歸方程為：Y=0.048 2X-0.003(R2=1)；左氧氟沙星測得測得吸收峰響應值高度與西司他丁鈉測得測得吸收峰響應值高度比值對左氧氟沙星濃度進行線性回歸，回歸方程為：Y=0.071 5X+0.013(R2=1)。

2.4回收率試驗 空白CM129培養(yǎng)液加入阿奇霉素與左氧氟沙星對照溶液, 各加入西司他丁鈉(1 mg/ml)做內(nèi)標后，使之成20、40和160 μg/ml不同濃度,內(nèi)標濃度25 μg/ml，按樣品處理后進樣,標準曲線上求得濃度與實際濃度相比得到回收率，重復3次，結(jié)果阿奇霉素和左氧氟沙星平均回收率分別為100.34%和99.83%，RSD分別為0.47%和1.08%。見表1。

表1 阿奇霉素和左氧氟沙星回收率測定結(jié)果

2.5精密度實驗 在空白CM 129培養(yǎng)液中加入阿奇霉素、左氧氟沙星及西司他丁鈉對照品配制高、中、低3種濃度的標準品CM 129培養(yǎng)液各5份, 按樣品處理方法進行處理，進行測定, 計算方法的日內(nèi)及日間精密度，阿奇霉素RSD為1.34%，左氧氟沙星RSD為0.94%，結(jié)果見表2。

2.6樣品測定結(jié)果 樣本1為生物膜剛形成加入阿奇霉素與左氧氟沙星，樣本2為生物膜形成5 d后加入阿奇霉素與左氧氟沙星。取上述兩種樣本，依“2.1”項下色譜條件進樣10 μl，分別檢測培養(yǎng)液中兩種藥物的濃度。結(jié)果見表3。從方法學驗證及檢測結(jié)果的重復性來看，此類檢測方法適合于此項實驗中樣本含量的測定。

表2 阿奇霉素和左氧氟沙星測量精密度試驗結(jié)果

表3 樣本結(jié)果測定值 μg/ml

3 討論

此分析方法的建立可以用于檢測透過生物膜的左氧氟沙星及阿奇霉素的濃度。對于銅綠假單胞菌生物膜的形成過程，目前已知氨溴索與乙酰半胱氨酸能促進左氧氟沙星(或環(huán)丙沙星)透過生物膜。從實驗結(jié)果上來看，阿奇霉素在生物膜形成的初期，阿奇霉素與左氧氟沙星對于銅綠假單胞菌生物膜都有透過作用，但是當生物膜形成之后，阿奇霉素對左氧氟沙星透過生物膜沒有影響，因此猜想阿奇霉素只有延緩生物膜形成的作用，對形成的生物膜并沒有類似于氨溴索的作用，在另外的電鏡實驗中也證明了此觀點。而對于左氧氟沙星自身能透過形成的生物膜，很可能左氧氟沙星本身在銅綠假單胞菌生物膜形成中，與PQS信號分子的結(jié)構(gòu)相似，生物膜中存在PQS信號分子的自由通道，因此喹諾酮類藥物自身對銅綠假單胞菌的生物膜就有透過作用。

1 潘強，張寧蘇，易大為，等.復方阿奇霉素葡萄糖注射液中阿奇霉素的HPLC測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(2)：99

2 劉皈陽, 張梅, 王睿,等.大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對加替沙星透過細菌生物被膜的影響.中華醫(yī)院感染學雜志，2005,15(7)：725