芽孢桿菌制劑和甘露聚糖制劑對(duì)家兔腸道生長(zhǎng)抑素的影響

陳 崗，沈 潔

（1.四川省自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 自貢 626000；2.四川省自貢市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，四川 自貢 626000）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及基礎(chǔ)日糧 48只40日齡斷奶加利福尼亞兔，雄性，預(yù)試5 d后，體重為750±101 g，購(gòu)自自貢市畜牧局種畜場(chǎng)。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照家兔的營(yíng)養(yǎng)需要，其配方見(jiàn)表1。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)：粗蛋白質(zhì)16.402 g/d·只，粗纖維10.460 g/d·只，消化能10.287MJ/d·只。

1.1.2 芽孢桿菌制劑和低聚糖 芽孢桿菌PAS38制劑：由自貢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室研制，含菌量為109cfu/g；β-甘露聚糖制劑：購(gòu)自湖北某生物工程有限公司，濃度>99%。

表1 家兔基礎(chǔ)日糧配方 %

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材 玻片、石蠟切片機(jī)、Nikon顯微鏡、溫箱、HC-TP-12型架盤天平、EPSON掃描儀。

1.1.4 試劑與藥品 Mouse Anti-rabbit Somatostatin、SABC免疫組化試劑盒、DAB，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；PBS緩沖液 0.02 M、pH 7.6，NaH2PO4·2H2O 0.5 g，Na2HPO4·12H2O 7 g，NaCl 9 g，D.D.W.1000mL，4%多聚甲醛磷酸緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及管理 將48只40日齡加利福尼亞兔隨機(jī)分為芽孢（0.1%蠟樣芽孢桿菌）組（Bacillus Group，簡(jiǎn)稱 BG）、寡糖（0.15%β-甘露聚糖）組（Oligos Group，簡(jiǎn)稱 OG）、混合（0.1%蠟樣芽孢桿菌＋0.15%β-甘露聚糖）組（Mix Group，簡(jiǎn)稱 MG）、對(duì)照組（Control Group，簡(jiǎn)稱CG），每組12只，見(jiàn)表2。飼喂時(shí)間為50d，其中預(yù)試期5 d，正式試驗(yàn)45 d。早上8∶00和晚上18∶00各喂一次飼料。日糧每天按組分別稱量飼喂，并將前次未采食完的日糧全部收集，曬干稱重。自由飲水，中午給予同樣質(zhì)量的青貯飼料。兔舍上午下午各打掃一次，保持兔舍內(nèi)空氣新鮮，每日平均溫度維持在26±2℃，保持周圍環(huán)境安靜，做好記錄。

表2 試驗(yàn)家兔分組情況

1.2.2 標(biāo)本制備 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于正式飼喂第15、30、45日早上8∶00空腹稱重后各組宰殺4只，采取空腸、十二指腸各一段，放入4%多聚甲醛中固定24 h，制成5μm厚石蠟切片，用APES處理載玻片，用于生長(zhǎng)抑素（SS）免疫組化分析。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色方法 石蠟切片脫蠟至水，用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物的活性10min，微波修復(fù)抗原1～2次，正常山羊血清封閉非特異性背景20min，依次加入一抗（Mouse Anti-Rabbit Somatostatin抗體濃度1∶200，4℃過(guò)夜），二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗兔血清，室溫下20min），SABC復(fù)合物（室溫 20min），以上各步間均以PBS緩沖液（0.02mol/L pH 7.6）洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 顯微圖像分析及結(jié)果處理 在Nikon數(shù)碼顯微鏡下觀察，拍照。每例動(dòng)物隨機(jī)選取5張切片，每張切片選取10個(gè)400倍視野計(jì)數(shù)，選取數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，然后運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并用LSD法作顯著性比較。

2 結(jié)果

SS陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在腸絨毛上皮之間，腸腺中分布較少，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。SS細(xì)胞中充滿免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)，尤以基底部及核周圍明顯，在細(xì)胞基底面及側(cè)面細(xì)胞膜外可見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)溢出，但腸腔及腺腔內(nèi)未見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)。十二指腸內(nèi)SS免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞多呈圓形和橢圓形，多數(shù)細(xì)胞為開(kāi)放型，可見(jiàn)細(xì)胞的突起伸向腺腔或腸腔面。

2.1 飼料中添加芽孢桿菌和β-甘露聚糖對(duì)家兔十二指腸SS陽(yáng)性細(xì)胞的影響 在陽(yáng)性細(xì)胞密度方面，芽孢桿菌組十二指腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組顯著減少（P<0.05）；飼喂30 d后，與對(duì)照組相比，芽孢桿菌組和甘露聚糖組十二指腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞比對(duì)照組顯著減少（P<0.05），而混合組比對(duì)照組極顯著減少（P<0.01）；飼喂45 d之后，各試驗(yàn)組十二指腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量已恢復(fù)到正常水平，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。

表3 家兔十二指腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞密度變化（±s） 個(gè)

表3 家兔十二指腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞密度變化（±s） 個(gè)

注：同列肩標(biāo)小寫字母相隔者表示差異極顯著 （P<0.01），標(biāo)不同小寫字母相鄰者表示差異顯著（P<0.05），標(biāo)相同字母或未標(biāo)字母者差異不顯著（P>0.05），下同。

組別 15 d 30 d 45 d十二指腸對(duì)照組 7.39±1.73a 9.37±1.97a 10.37±2.04芽孢組 5.74±1.60b 7.19±1.88bc 9.69±1.94寡糖組 6.49±1.70ab 7.40±1.87bc 9.92±2.01混合組 6.03±1.61ab 6.50±1.80c 8.72±1.92

圖1 各組家兔十二指腸SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化的比較

在平均灰度值方面，飼喂15 d后，3個(gè)試驗(yàn)組十二指腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）；飼喂30 d后，3個(gè)試驗(yàn)組十二指腸中的SS平均灰度值比對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；飼喂45 d之后，各試驗(yàn)組十二指腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值已接近對(duì)照組水平，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4和圖2。

表4 家兔十二指腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度變化（±s）

表4 家兔十二指腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度變化（±s）

組別 15 d 30 d 45 d十二指腸對(duì)照組 145.69±12.76 132.54±10.28a 128.42±9.24芽孢組 154.51±13.17 147.67±11.52b 134.20±11.37寡糖組 149.39±11.62 144.06±9.86b 130.29±8.75混合組 152.58±11.26 150.90±12.38b 136.57±12.58

2.2 飼料中添加芽孢桿菌和β-甘露聚糖對(duì)家兔空腸SS陽(yáng)性細(xì)胞的影響 在陽(yáng)性細(xì)胞密度方面，飼喂15d后，3個(gè)試驗(yàn)組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均比對(duì)照組顯著減少（P<0.05）；飼喂30 d后，與對(duì)照組相比，甘露聚糖組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05），芽孢桿菌組和混合組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量極顯著減少（P<0.01）；飼喂45 d之后，芽孢桿菌組和甘露聚糖組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)恢復(fù)到正常水平，而混合組與對(duì)照組相比，仍有顯著差異（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5和圖3。

圖2 各組家兔十二指腸SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值變化的比較

表5 家兔空腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞密度變化（±s） 個(gè)

表5 家兔空腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞密度變化（±s） 個(gè)

組別 15 d 30 d 45 d空腸對(duì)照組 7.09±1.67a 8.47±1.92a 9.58±2.01a芽孢組 5.36±1.66b 6.04±1.75c 8.96±1.86ab寡糖組 5.40±1.75b 6.51±1.73bc 8.78±1.94ab混合組 5.16±1.69b 5.79±1.79c 7.72±1.80b

圖3 各組家兔空腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化的比較

在平均灰度值方面，飼喂15 d后，芽孢桿菌組和混合組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值均比對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；飼喂30 d后，與對(duì)照組相比，甘露聚糖組的平均灰度值顯著升高（P<0.05），芽孢桿菌組和混合組極顯著升高（P<0.01）；飼喂45 d之后，芽孢桿菌組和甘露聚糖組空腸中的SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值已經(jīng)接近對(duì)照組水平，而混合組與對(duì)照組相比，仍有顯著差異（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表6和圖4。

表6 家兔空腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度變化（±s）

表6 家兔空腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度變化（±s）

組別 15 d 30 d 45 d空腸對(duì)照組 139.19±8.62a 129.57±8.24a 125.31±10.80a芽孢組 151.36±11.32b 142.75±10.30bc 131.52±9.47ab寡糖組 147.27±9.72ab 140.21±9.62bc 128.45±8.27ab混合組 153.51±12.64b 146.43±12.52c 137.24±11.32b

3 分析與結(jié)論

圖4 各組家兔空腸SS陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值變化的比較

生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SS）陽(yáng)性細(xì)胞分布很廣泛，不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且存在于所有動(dòng)物的胃腸道中，是小腸中一種主要的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。SS對(duì)胃腸道消化吸收及其他內(nèi)分泌細(xì)胞起普遍性的抑制作用，如抑制幾乎所有胃腸激素，比如胃泌素、血管活性腸肽、胰泌素和胃動(dòng)素等；抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，因此對(duì)機(jī)體的消化吸收功能有重要影響。SS還可以抑制T淋巴細(xì)胞的活動(dòng)和淋巴細(xì)胞免疫球蛋白的合成，SS對(duì)IgA合成的抑制作用可高達(dá)20%～50%。

本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法，用DAB作顯色劑對(duì)SS陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，結(jié)果顯示，芽孢桿菌和甘露聚糖均能夠使家兔小腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞密度降低，從而降低了SS對(duì)其他內(nèi)分泌細(xì)胞和胃腸激素的抑制作用，增強(qiáng)了胃腸道的消化吸收功能。從飼喂的各個(gè)時(shí)期來(lái)看，芽孢桿菌組小腸中SS陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量均低于甘露聚糖組，說(shuō)明兩者單獨(dú)使用時(shí)，芽孢桿菌對(duì)內(nèi)分泌免疫的調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于甘露聚糖。

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