食品動(dòng)物源沙門菌oqxAB基因的檢測(cè)及水平傳播機(jī)制研究

劉 繼，宋 立，魏飛龍，湯 電，張靜遠(yuǎn)，張小華，李 健，蔣紅霞

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東廣州510642;2中國(guó)獸藥監(jiān)察所，北京100081)

氟喹諾酮類藥物是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床廣泛使用的一類化學(xué)合成抗菌藥，其中環(huán)丙沙星是首個(gè)用于臨床，對(duì)革蘭陰性菌有極強(qiáng)抗菌活性的藥物.恩諾沙星是該類藥物中的第一個(gè)動(dòng)物專用藥物，在體內(nèi)可代謝為環(huán)丙沙星.隨著氟喹諾酮類藥物長(zhǎng)期廣泛用于獸醫(yī)臨床，腸道桿菌對(duì)這些藥物的耐藥性已經(jīng)非常普遍，并且耐藥性多以獨(dú)立的、非克隆形式廣泛傳播.過去普遍認(rèn)為細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要是藥物作用靶位發(fā)生改變、細(xì)菌細(xì)胞膜外排泵表達(dá)增強(qiáng)及細(xì)胞膜通透性下降［1］.自從1998年首次發(fā)現(xiàn)了qnr基因——一個(gè)可隨質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的基因，其編碼的Qnr蛋白可以保護(hù)DNA旋轉(zhuǎn)酶免受氟喹諾酮藥物的作用而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，揭示了細(xì)菌也存在質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥(Plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR)機(jī)制［1］.目前發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類藥物耐藥決定基因有 qnrA、qnrS、qnrB、qnrC、qnrD、aac(6')-1bcr、qepA和oqxAB，其中qepA基因和oqxAB基因是近幾年才發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的耐氟喹諾酮類外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因.丹麥科學(xué)家 S?rensen等［2］2003年從豬堆肥中分離的大腸埃希菌Escherichia coli中鑒定出一個(gè)可介導(dǎo)對(duì)獸醫(yī)臨床促生長(zhǎng)劑喹乙醇耐藥性的接合質(zhì)粒.該質(zhì)粒上攜帶一個(gè)多藥外排泵OqxAB，屬于RND家族.OqxAB在天然缺乏acrA基因的大腸埃希菌中特異表達(dá)，使萘啶酸和環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌的最低抑菌濃度(MIC)分別提高8倍和16倍.目前質(zhì)粒介導(dǎo)的OqxAB在人源大腸埃希菌中也檢測(cè)到，同時(shí)在肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia也發(fā)現(xiàn)位于染色體上的oqxAB基因［2-7］.

我國(guó)是動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性最嚴(yán)重的國(guó)家之一，耐藥性在動(dòng)物、環(huán)境和人群間的擴(kuò)散和傳播已成為人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問題.沙門菌Salmonella是重要的食源性人獸共患病原菌，其耐藥性的擴(kuò)散和傳播對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生具有重要影響.本研究對(duì)2009年從患病的豬、鴨、鵝分離的31株沙門菌進(jìn)行耐藥性分析，調(diào)查oqxAB基因在沙門菌的流行分布，并通過接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)分析oqxAB基因水平傳播機(jī)制，為動(dòng)物源性沙門菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 沙門菌臨床株的分離和鑒定

2009年10月至2010年2月從佛山科技大學(xué)教學(xué)獸醫(yī)院采集的患病動(dòng)物或送檢動(dòng)物(包括豬、鴨和鵝)尸體的直腸拭子，每個(gè)動(dòng)物只采集1個(gè)樣品，分離沙門菌.具體步驟:直腸拭子置于SC增菌液中，37℃培養(yǎng)12～16 h，再用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)過的增菌液在SS平皿上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12～16 h.挑取透明(或者頂部有黑點(diǎn))的針尖狀單菌落在SS平皿上連續(xù)傳代純培養(yǎng)，直至菌落中無(wú)雜色.革蘭染色鏡檢確定無(wú)雜菌時(shí)，純培養(yǎng)物添加體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油，置于 -20℃冰箱保存［8］.

純培養(yǎng)物經(jīng)生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定［9］(PCR擴(kuò)增invA基因)后確定為沙門菌.

1.2 沙門菌血清型鑒定

各沙門菌純培養(yǎng)物分別與沙門菌菌屬診斷血清O多價(jià)、O復(fù)合因子、H多價(jià)因子血清做玻片凝集反應(yīng).根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，分別選用O單價(jià)及H單價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立生理鹽水為對(duì)照組.

1.3 主要試劑

rTaq酶、DL2000 DNA marker、10 × Loading Buffer、pMD19-T載體，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品.SC增菌液、SS瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品.沙門菌屬診斷血清，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖，英國(guó) Difico公司產(chǎn)品.胰蛋白胨(Tryptone)、酵母浸出物(Yeast extract)，英國(guó) Oxiod公司產(chǎn)品.

1.4 臨床分離沙門菌敏感性測(cè)定

沙門菌臨床分離株敏感性測(cè)定按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行，敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)［10］.受試藥物包括乙酰甲喹、喹乙醇、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素、大觀霉素、鏈霉素，共18種藥物.沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCCAB94008為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室保存.

1.5 沙門菌invA基因和oqxAB基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank沙門菌種特異性invA基因序列(登錄號(hào):NC_011294.1)［9］和沙門菌 oqxA基因和oqxB基因序列(登錄號(hào):GQ497565.1)分別設(shè)計(jì)引物，引物和PCR運(yùn)行條件見表1.沙門菌總DNA采用熱裂解法制備.

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/mL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物直接送往上海英駿公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行Blast分析.

1.6 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)以oqxAB基因陽(yáng)性沙門菌作為供體菌，大腸埃希菌J53AziR為受體菌.按體積比1∶4將供體菌和受體菌培養(yǎng)液混合，靜置培養(yǎng)4 h.5 000 r/min離心4 min，棄去上清，加0.2 mL的滅菌生理鹽水做10-1和10-2的梯度稀釋.取上述菌液0.1 mL涂布于適當(dāng)質(zhì)量濃度的氯霉素/喹乙醇的MH瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24 h.挑單菌落至LB肉湯震蕩培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增oqxAB基因進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性者則為接合子.采用二倍瓊脂稀釋法測(cè)定接合子MIC值.

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及運(yùn)行條件Tab.1 Sequences of specific primers used in PCR assay，size of amplicons and running conditions

2 結(jié)果

2.1 沙門菌血清型鑒定

共分離鑒定了31株沙門菌，其中豬源9株，鴨源20株，鵝源2株.31株沙門菌血清型分別為印第安納沙門菌S.indiana 21株，尼特拉沙門菌S.nitra 4株，巴吞魯日沙門菌S.batonrouge 2株，另有海森歌沙門菌S.hisingen、內(nèi)夫騰巴赫沙門菌 S.neftenbach、堡壘沙門菌S.bergues、坎特沙門菌S .charters各1 株.

2.2 31株臨床分離沙門菌的抗菌藥物敏感性測(cè)定

臨床分離的沙門菌菌株對(duì)18種藥物的耐藥率和敏感率結(jié)果見表2.從表2可以看出31株臨床分離沙門菌對(duì)所有受試藥物都表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，為64.5%，其次是鏈霉素，61.3%.對(duì)氨基糖苷類其他藥物、氯霉素類、四環(huán)素類的耐藥率為42%～55%，對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率約45%.對(duì)頭孢類藥物耐藥率相對(duì)較低，約20%;對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹的耐藥率為38.7%.

表2 臨床分離沙門菌對(duì)18種抗菌藥物的敏感性測(cè)定結(jié)果Tab.2 Susceptibilities of Salmonella isolates to 18 antimicrobials

2.3 臨床分離沙門菌oqxAB基因的擴(kuò)增

各分離株用oqxAB基因特異性引物擴(kuò)增，分別得到約500 bp和＞500 bp的目的條帶(圖1、2).經(jīng)測(cè)序，共檢測(cè)出12株沙門菌攜帶oqxAB基因.

圖1 oqxA基因的PCR擴(kuò)增圖Fig.1 Agarose gel elephoresis of PCR products of oqxA gene

圖2 oqxB基因的PCR擴(kuò)增圖Fig.2 Agarose gel elephoresis of PCR products of oqxB gene

2.4 接合子的鑒定及MIC測(cè)定

將12株檢測(cè)到oqxA基因和oqxB基因的沙門菌進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，挑選疑似接合子的單菌落，用oqxA基因和oqxB基因的特異性引物進(jìn)行菌落 PCR鑒定(圖3、4).結(jié)果共獲得5株oqxAB基因陽(yáng)性接合子，接合成功率為41.7%.5株oqxAB基因陽(yáng)性接合子及原菌株敏感性測(cè)定結(jié)果見表3.

圖3 疑似接合子的oqxA基因的PCR擴(kuò)增圖Fig.3 Agarose gel elephoresis of PCR products of oqxA gene from suspected transconjugants

圖4 疑似接合子的oqxB基因的PCR擴(kuò)增圖Fig.4 Agarose gel elephoresis of PCR products of oqxB gene from suspected transconjugants

表3 oqxAB基因陽(yáng)性接合子MICTab.3 The MICs of oqxAB gene positive transconjugants μg·mL-1

3 討論與結(jié)論

沙門菌是重要的人畜共患病病原之一，也是重要的食源性污染病原菌，在發(fā)展中和發(fā)達(dá)國(guó)家仍然易造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題.近年來(lái)食源性沙門菌的耐藥性急劇上升，多重耐藥菌株日益增多，耐藥性可通過食物鏈傳播給人，造成醫(yī)院臨床治療的失敗.馬孟根等［10］調(diào)查了30株豬源致病性沙門菌的耐藥狀況，沙門菌對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、磺胺甲基異惡唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素、卡那霉素和氯霉素耐藥率分別為 83.3%、80%、80%、76.7%、60%、56.7% 和56.7%.王曉泉等［11］調(diào)查了江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門菌對(duì)16種抗生素的敏感性，結(jié)果50.4%的菌株對(duì)5種以上的抗生素耐藥，部分菌株對(duì)頭孢菌素類耐藥.本研究分離的31株沙門菌，對(duì)常用藥物呈現(xiàn)中等程度的耐藥，對(duì)重要抗生素(氟喹諾酮類藥物)的耐藥率達(dá)45%左右，對(duì)頭孢菌素的耐藥率高于前人［4］的研究報(bào)道，對(duì)喹乙醇的耐藥率為38.7%.本研究31株沙門菌主要來(lái)自鴨(20株)，大多為多重耐藥菌，與鐘傳德等［12］對(duì)175株鴨源致病性沙門菌的耐藥性調(diào)查所得結(jié)果相似.

喹乙醇除了具有抗菌作用外，還有蛋白同化作用，能提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高豬的增質(zhì)量率，因此一直作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑而廣泛應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè).近年來(lái)抗生素作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑的用法也成為受爭(zhēng)議的話題，歐盟國(guó)家已禁止抗生素作為促生長(zhǎng)劑的應(yīng)用.丹麥學(xué)者S?rensen等［2］在一次調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物中存在對(duì)喹乙醇耐藥的菌株，獲得了具有高接合轉(zhuǎn)移頻率的耐藥質(zhì)粒，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒同時(shí)介導(dǎo)對(duì)喹乙醇和氨芐西林耐藥，并一定程度上對(duì)氯霉素和呋喃妥因耐藥.對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切測(cè)序發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對(duì)喹乙醇耐藥是由質(zhì)粒上oqxAB基因編碼的外排泵(OqxAB)介導(dǎo)的.OqxAB為多藥外排泵，表達(dá)依賴于TolC 外膜蛋白［2-3，5］.編碼 OqxAB 的質(zhì)?？奢^容易地水平傳遞到其他腸道病原菌，如沙門菌、肺炎克雷伯菌、克羅非菌Kluyver sp.和產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes，接合子對(duì)喹乙醇、氯霉素和環(huán)丙沙星的敏感性降低［6］.獲得的攜帶OqxAB耐藥質(zhì)粒的菌株，除了介導(dǎo)對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹耐藥外，同時(shí)還表現(xiàn)出對(duì)氯霉素類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物耐藥，同時(shí)還介導(dǎo)對(duì)氨芐西林和氯霉素的連鎖耐藥［2，5］.目前國(guó)內(nèi)外只發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌中攜帶OqxAB的耐藥質(zhì)粒.本研究在沙門菌中檢測(cè)到oqxAB基因，31株沙門菌中有12株攜帶oqxAB基因，檢出率為39%.采用接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)分析oqxAB基因陽(yáng)性菌耐藥基因是否發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5株沙門菌oqxAB基因隨質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移.對(duì)5株oqxAB基因陽(yáng)性接合子MIC測(cè)定結(jié)果顯示，所有接合子都獲得了原菌株對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素和喹乙醇等藥物的耐藥表型，說(shuō)明介導(dǎo)這些藥物的耐藥基因可能隨同oqxAB基因一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這與前人［2，7］研究報(bào)道一致.另外在本試驗(yàn)中有1株同時(shí)對(duì)氟喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類耐藥的菌株，其接合子也觀察到對(duì)這兩類藥物的敏感性有所下降，這證實(shí)了多藥外排泵OqxAB與氟喹諾酮類藥物耐藥性之間存在著必然聯(lián)系［11］.但是介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因是否也隨oqx-AB基因發(fā)生連鎖轉(zhuǎn)移，還需進(jìn)一步研究證實(shí).

本研究在沙門菌中檢測(cè)出質(zhì)粒源OqxAB外排泵編碼基因.喹乙醇作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)養(yǎng)殖，在喹乙醇選擇壓力下篩選的耐藥菌株，其耐藥基因oqxAB可隨質(zhì)粒發(fā)生轉(zhuǎn)移，甚至可能與介導(dǎo)四環(huán)素、氯霉素、氟喹諾酮類以及β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因發(fā)生連鎖轉(zhuǎn)移.沙門菌作為重要的食源性污染菌，耐藥質(zhì)粒隨之傳播將對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，提示動(dòng)物養(yǎng)殖過程中要慎用喹乙醇類抗生素促生長(zhǎng)劑.

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