養(yǎng)心顆粒含藥血清對豚鼠心室肌細胞外向延遲整流K電流的影響

張春芳，客蕊，孟濤，汪洋，周亞濱

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，哈爾濱 150040)

養(yǎng)心顆粒由《證治準(zhǔn)繩》養(yǎng)心湯化裁而來，具有益氣養(yǎng)心安神的作用。臨床研究表明［1-4］，其不僅可降低心律失常的發(fā)生率，同時還可減少抗心律失常藥物的用量。動物實驗發(fā)現(xiàn)［5-8］，養(yǎng)心顆?？筛纳萍彝眯募〗M織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATP ase活性，通過阻斷心肌細胞Na+通道，抑制Na+離子過度內(nèi)流，促進K+外流，使冠心病快速型心律失常出現(xiàn)時間延遲、持續(xù)時間縮短。但其對心臟鉀通道的影響尚未見報道。本實驗采用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察養(yǎng)心顆粒含藥血清對心肌細胞動作電位(AP)及外向延遲整流K電流(Ik)的影響，探討其抗心律失常的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性豚鼠40只，體質(zhì)量250～350 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號碼為:SCXK-［吉］2003-t001。

1.2 藥物和試劑 養(yǎng)心顆粒:黃芪、茯神、半夏、當(dāng)歸等十三味中藥，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備成顆粒粉末，每克粉末含生藥量為6.2g。

HEPES、EGTA、Na2-ATP、小牛血清蛋白(BSA)、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司，臺氏液及細胞貯存液(KB)液試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 CEZ-2400型膜片鉗放大器;Olympus倒置顯微鏡;ModelJD200-3精密電子天平;Narishige微電極拉制儀;Sakupa恒溫磁力攪拌器;Narishige三維操縱器;Narishige恒流泵;1200 series Interface數(shù)-模轉(zhuǎn)換器(美國);Langendorff灌流裝置。

1.4 溶液 分離心肌細胞和記錄動作電位所需溶液含 Ca2+臺式液:(mmol/ml):NaCl 143，KCl 5.4，CaCl2-2H2O 1.8，MgCl2-6H2O 0.5，NaH2PO4-2H2O 0.25，HEPES 5。用 NaOH 調(diào)PH值至7.4。無 Ca2+臺式液去掉上述臺式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同;KB液(mmol/ml):KOH 70，L-谷氨酸 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2-6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，用 KOH 調(diào) pH值至 7.4;灌流液(mmol/L):NaCl 143，KCl 5.4，MgCl20.5，CaCl21.8，NaH2PO40.25，HEPES 5，Glucose 10，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.4;電極內(nèi)液(mmol/L):KCl 140，MgCl22，EGTA 2，CaCl21.8，HEPES 5，Na2-ATP 10，用1 mol/L KOH 將pH 調(diào)至7.2。實驗在室溫在22～24℃進行。記錄鉀通道Ik所需溶液:細胞外液(mmol/L):NaCl 140，KCl 5.4，MgCl2·6H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1，CaCl2·2H2O 2.0，Glucose 10，TTX 0.03，HEPES 10，用 NaOH 調(diào)pH直至7.2～7.4(室溫29℃)。其中 TTX阻斷鈉通道，Cd2+阻斷鈣通道。電極液(mmol/L):potassi-um aspartate 80，KCl 42，KH2PO410，Mg2+-ATP 10，phosphocreatin 3，K+-EGTA 5，K+-HEPES 5，用 KOH調(diào) pH 直至7.2 ～7.4(室溫29℃)。

1.5 方法

1.5.1 養(yǎng)心顆粒含藥血清制備 養(yǎng)心顆粒各組豚鼠每100克體質(zhì)量灌2 ml藥液(7.54 g/kg)，每日給藥2次，早晚各1次，空白組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)給藥1周，于末次給藥后1 h心臟取血，于4℃靜置2 h后，低溫離心機離心，3500 r/min，離心15 min，將分離的血清同組混合，經(jīng)56℃恒溫滅活30 min處理后，在超凈臺上用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 實驗分組［9-10］40只豚鼠隨機分為4組，空白對照組10只，給予普通細胞外液灌流;2%養(yǎng)心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養(yǎng)心顆粒血清至其濃度達2%;4%養(yǎng)心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養(yǎng)心顆粒血清至其濃度達4%;8%組養(yǎng)心顆粒血清組10只，于普通細胞外液加入養(yǎng)心顆粒血清至其濃度達8%。

1.5.3 心室肌細胞的分離［11］豚鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后給予氣管插管，開胸做冠狀動脈插管，然后取心臟并固定于langendorff灌流架上，從主動脈逆向灌流含Ca2+臺式液2 min后，無Ca2+臺式液灌流5 min，最后用膠原酶 (15 mg/100 ml)的無Ca2+臺式液灌流10 min，從房室溝處剪下左心室放入細胞貯存液中，振蕩10 min(37℃)，吹打成單個心室肌細胞，置于KB液中，4℃冰箱中保存。灌流過程中持續(xù)通O2，灌流液溫度控制在37℃，灌流速度8 ml/min(室溫21℃)。

1.5.4 全細胞記錄單個心室肌細胞AP和外向延遲整流鉀離子流 選擇邊緣清楚、橫紋清晰的中等大小的心室肌細胞。微電極充灌電極液后，電阻為1～3 MΩ。將已加正壓的微電極緩緩插入浴液，直至接觸心肌細胞表面，持續(xù)負壓吸引。當(dāng)電極尖端與細胞膜表面形成1～5GΩ封接電阻時，用力吸破電極尖端上的膜片，形成全細胞記錄。應(yīng)用電流鉗方法，給予時程10 ms、1次/S、幅度為1～2 nA的電流脈沖，引導(dǎo)出豚鼠心室肌細胞的動作電位，并輸入計算機分析動作電位的幅度(APA)、靜息電位(RP)、Vmax、動作電位復(fù)極 50%、90% 時程(APD50、APD90)各項指標(biāo)。穩(wěn)定3 min后，分別以普通細胞外液或含2%、4%、8%養(yǎng)心顆粒血清的細胞外液灌流，10 min后再次觀察。在全細胞電壓鉗狀態(tài)下用鉀離子通道外液灌流10 min，穩(wěn)定10 min后，以遞增方式以含養(yǎng)心顆粒血清2%、4%、8%的細胞外液灌流，每一細胞灌流2～3個濃度，再以正常電極外液沖洗10 min，記錄不同階躍電壓水平(從－50 mV到+50 mV，每次階躍命令為+10 mV，時程為400 ms)時的IK電流。為消除細胞間誤差，電流大小以電流密度(pA/pF)來表示。

1.5.5 數(shù)據(jù)的采集及分析 通過膜片鉗放大器記錄最大峰值的鉀電流，放大、濾波后數(shù)字信號，由Pclamp 6.03軟件控制，其數(shù)字化頻率為10 kHz，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS14.0軟件，所有實驗數(shù)據(jù)用表示，多組間比較用F檢驗，多組間兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響

在分離的單個豚鼠心室肌細胞上，應(yīng)用全細胞電流鉗的方式，引導(dǎo)出單個心室肌細胞的動作電位，測量動作電位的 Vmax、RP、APA、APD50和 APD90的參數(shù)。實驗中觀察了2%、4%、8%的養(yǎng)心顆粒含藥血清對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響，見表1。

2.2 試藥血清對豚鼠心室肌細胞Ik的作用 在電壓鉗模式下記錄電流，為避免Ik出現(xiàn)隨時間而衰減的現(xiàn)象，所有記錄均在10 min內(nèi)完成。將保持電位控制在－50 mV，檢測電位從 －50 mV到+50 mV，階躍命令為+10 mV，時程為400 ms。空白組Ik在－30 mV時被激活，最大外向峰值電流成分在+50 mV，其峰值電流為［(16.11 ±1.67)pA/pF，n=10］，電流對TEA敏感 (5μΜ)，電流成分被明顯抑制，表明電流成分對為對TEA敏感的鉀電流。Ik電流記錄穩(wěn)定后，加入2%、4%和8%養(yǎng)心顆粒含藥血清灌流液，約2 min后，其峰值鉀電流分別為［(15.78±1.66)、(15.33 ±1.56)、(14.33 ±1.11)pA/pF，n=10］4%、8%含藥血清組明顯抑制Ik電流，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作點位的作用()

表1 試藥血清對豚鼠心室肌細胞動作點位的作用()

注:與空白對照組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01

組別 鼠數(shù)(只) APA(V/mV) Vmax RP(V/mV) APD50(t/ms) APD90(t/ms)±33.16 285.33 ±37.25 2%養(yǎng)心組 10 110.33 ±7.76 29.67 ±2.42 79.67 ±0.82 221.50 ±35.99 293.17 ±41.47 4%養(yǎng)心組 10 106.17 ±8.45 28.83 ±2.64 79.00 ±1.79 267.33 ±39.83a 341.50 ±42.60a 8%養(yǎng)心組 10 108.83 ±9.15 32.00 ±4.52 79.83 ±1.17 286.50 ±42.28b 356.33 ±26.43空白對照組 10 110.33 ±6.77 31.67 ±3.61 79.67 ±1.63 215.00 b

3 討論

心肌細胞動作電位的產(chǎn)生與心肌膜上的離子通道、離子流有密切關(guān)系，是細胞膜上多種離子通道順序開關(guān)綜合作用的結(jié)果。動作電位在不同的種屬之間存在差異，豚鼠的動作電位平臺期很長，比較容易研究藥物對動作電位時程的作用。適度延長APD對折返性心律失常的發(fā)生有抑制作用。但APD延長超過50%，易引起QT間期延長，則可能誘發(fā)早后除極及異常的觸發(fā)活動，是發(fā)生多形性室速的基礎(chǔ)。當(dāng)靜息電位水平降低，0期去極化速度減慢，可引起傳導(dǎo)性下降，產(chǎn)生單向傳導(dǎo)阻滯或傳導(dǎo)減慢，兩者同時出現(xiàn)易致興奮折返發(fā)生，而引起快速性心律失常。因此，心肌傳導(dǎo)性降低也是發(fā)生心律失常的原因。

本實驗結(jié)果顯示，養(yǎng)心顆粒4%、8%組均能明顯延長豚鼠心室肌細胞動作電位時程APD50和APD90，以養(yǎng)心顆粒8%組影響更明顯，但也未超過35%，明顯低于致心律失常的值，養(yǎng)心顆粒2%組則無明顯影響。提示養(yǎng)心顆粒通過延長動作電位時程，使心室肌有效不應(yīng)期延長，從而抑制折返性心律失常的形成，且可能有一定的濃度關(guān)系。養(yǎng)心顆粒各組對靜息電位、0期去極化速度無明顯影響。提示養(yǎng)心顆粒對心肌傳導(dǎo)性無明顯影響，不會引起心律失常。本實驗過程中也未發(fā)現(xiàn)致心律失常豚鼠。

動作電位時程是各種電流變化的綜合結(jié)果。既然動作電位時程有變化，必然存在離子電流的改變［12］。除了動作電位開始的0相去極化外，復(fù)極化(即1，2，3期)均與K+通道有關(guān)，Ik在復(fù)極2相激活，是平臺期的主要外向電流，對平臺期的時程起決定性作用;3相復(fù)極早期主要由Ik逐漸增強造成，3相復(fù)極晚期由Ik和少量Ik1的外向電流共同形成。Ik是調(diào)節(jié)豚鼠心室肌細胞復(fù)極化的主要離子流，對心室肌細胞動作電位2相平臺期的終止及3相復(fù)極化具有重要意義［13］，它的改變將直接影響心室肌動作電位時程的長短。

本實驗結(jié)果顯示，養(yǎng)心顆粒4%、8%組峰值鉀電流分別為 15.33 ±1.56、14.33 ±1.11，表現(xiàn)為電流密度—電壓曲線上移，對豚鼠心室肌Ik均有明顯的抑制作用，養(yǎng)心顆粒2%組則無明顯影響。提示養(yǎng)心顆粒通過抑制延遲整流 K+通道來延長ADP50、ADP90，從而延長有效不應(yīng)期，發(fā)揮其抗心律失常的作用，且可能有一定的濃度依賴性。

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