甲狀腺激素對(duì)大鼠額葉乙酰膽堿的影響

劉俊霞，朱德發(fā)，王芬，王取南，馬維青

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230061;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科;3.安徽醫(yī)科大學(xué)毒理實(shí)驗(yàn)室)

甲狀腺功能減退癥(甲減)可引起認(rèn)知功能損傷，包括記憶、注意、執(zhí)行功能等方面［1］。乙酰膽堿(ACh)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在腦內(nèi)廣泛存在，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。甲減導(dǎo)致乙酰膽堿含量變化的報(bào)道甚少，額葉是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)。因此，本研究將26只普通級(jí)健康成年期雄性SD大鼠分為甲減組、甲狀腺素替代治療組、健康對(duì)照組三組，采用含丙基硫氧嘧啶 (PTU)的自來水誘導(dǎo)建立甲減模型，以乙酰膽堿為指標(biāo)，采用堿性羥胺比色法測(cè)定各組大鼠額葉內(nèi)乙酰膽堿含量，探討甲減對(duì)額葉內(nèi)乙酰膽堿的影響及替代治療效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)健康成年期雄性SD大鼠26只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自南京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下喂養(yǎng)，自然采光，所有大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 儀器 T3、T4、TSH采用放射免疫試劑盒(北方生物技術(shù)研究所)，檢測(cè)儀器為DFM-96型16管放射免疫γ計(jì)數(shù)器;－80℃冰箱;勻漿器;離心機(jī);37℃恒溫箱;酶標(biāo)儀(Biote，美國(guó)伯騰儀器有限公司);96孔板。

1.2.2 試劑 PTU、T4(Sigma公司);BCA Protein Assay Kit(Thermo公司);1.5 mmol/L毒扁豆堿(PSS);堿性羥胺(3.5 mol/L NaOH與2 mol/L鹽酸羥胺等量混合);1.84 mol/L三氯乙酸;0.37 mol/L FeC13，稱 三 氯 化 鐵 (AR，F(xiàn)eC13·6H2O)50g，加0.1 mol/L HCl至500m1，過濾后備用;標(biāo)準(zhǔn)貯存液(5 mg/m1):氯化乙酰膽堿62.15 mg或溴化乙酰膽堿77.34 mg(相當(dāng)于 Ach 50 mg)，加 pH4.0鹽酸(0.1 mmol/L)至10 ml，分裝安瓶－20℃保存至少可用半年;標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(Ach 0.5 mg/ml):將上液用蒸餾水稀釋10倍即得。

1.3 動(dòng)物模型建立和標(biāo)本制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為3組:健康對(duì)照組、甲減組、替代治療組。所有大鼠均喂養(yǎng)6周，對(duì)照組大鼠6周均每日飲用自來水;甲減組大鼠每日飲用含0.05%PTU的自來水6周;替代治療組大鼠每日飲用含0.05%PTU的自來水4周，第5周起開始腹腔注射左旋 T46 μg·kg－1·d－1。每周測(cè)體質(zhì)量 1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。實(shí)驗(yàn)研究遵循“實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物管理和使用指南”。

1.4 標(biāo)本制備 待測(cè) T3、T4、TSH的血清來源于腹主動(dòng)脈血，腦標(biāo)本來源于取血后在冰上迅速分離的腦組織，置于－80℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 甲狀腺素水平測(cè)定 血清 T3、T4、TSH水平采用放射免疫法測(cè)定。

1.6 堿性羥胺比色法測(cè)腦組織內(nèi)乙酰膽堿含量

1.6.1 乙酰膽堿測(cè)定步驟 采用堿性羥胺比色法［2］測(cè)定。斷頭后于冰臺(tái)迅速取大腦額葉部位組織，用精密電子稱重儀稱質(zhì)量，按1∶9(每1克腦組織加9 ml0.9%氯化鈉溶液)用玻璃勻漿器制作成腦組織勻漿。(1)取腦組織勻漿0.2 ml加0.35 ml蒸餾水混合，再加 1.5 mmol/L 毒扁豆堿 0.05 ml，緩慢加入1.84 mol/L三氯乙酸0.2 ml充分混合，離心5000 r/min×5 min后取上清進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定4個(gè)管:測(cè)定管(A)、標(biāo)準(zhǔn)管(B)、對(duì)照管(C)、空白管(D)。(A):取腦組織上清100μl加入測(cè)定管，再加入堿性羥胺100μl，于室溫置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化鐵各50 ml;(B):標(biāo)準(zhǔn)管中依次加入標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(乙酰膽堿0.5 mg/ml)10 μl、毒扁豆堿 10 μl、雙蒸水 55 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25μl，再加入堿性羥胺100 μl，于室溫置15 min后依次加入4 mol/L HCl和0.37 mol/L三氯化鐵各50ml;(C):取腦組織上清100μl加入對(duì)照管，于室溫置15 min后依次加入0.37 mol/L 三氯化鐵 50 μl、4 mol/L HCl 50 ml、堿性羥胺100μl;(D):空白管中依次加入毒扁豆堿10 μl、雙蒸水65 μl、三氯乙酸(1.84 mol/L)25 μl，于室溫置15 min后依次加入0.37 mol/L三氯化鐵50 μl、4 mol/L HCl50ml、堿性羥胺 100 μl。以上各管每加入一個(gè)試劑均應(yīng)充分振搖混勻。最后各管取200μl至96孔板中在酶標(biāo)儀492 nm處比色。(2)BCA法測(cè)定腦組織蛋白含量:取腦組織勻漿200μl在4℃離心機(jī)15 000 r/15 min離心，取上清按BCA試劑盒說明書操作。

1.6.2 結(jié)果計(jì)算 (1)按照比色法公式計(jì)算:腦組織乙酰膽堿含量(μg/ml)=(A測(cè)定管－B對(duì)照管)/(C標(biāo)準(zhǔn)管－D空白管)×3.2/0.8×50

(2)每單位腦組織蛋白中所含乙酰膽堿(μg/mg)=比色法公式計(jì)算所得腦組織Ach含量(μg/ml)/蛋白含量(mg/ml)

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清T3、T4、TSH水平 與健康對(duì)照組相比，甲減組大鼠血清 T3、T4水平顯著減低，TSH水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;甲狀腺素替代治療后，血清T3、T4、TSH恢復(fù)至正常水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 三組大鼠額葉內(nèi)乙酰膽堿含量 與健康對(duì)照組［(24.40±6.16)μg/mg］相比，甲減組大鼠額葉內(nèi)乙酰膽堿含量［(17.59 ±2.70)μg/mg］減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。替代治療后Ach含量［(19.34 ±4.42)μg/mg］恢復(fù)至正常水平，與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

表1 各組大鼠血清 T3、T4、TSH水平()

注:與健康對(duì)照組比較，a P＜0.05

組別 鼠數(shù)(只)T3(nmol/L) T4(nmol/L)TSH(μIU/ml)9 0.83 ±0.09 49.81 ±3.73 1.11 ±0.48甲減組 8 0.60 ±0.09a 18.19 ±5.70a 19.78 ±9.99a T4-6健康對(duì)照組9 0.83 ±0.25 52.42 ±6.06 1.21 ±1.01

3 討論

Ach是記憶、學(xué)習(xí)功能重要的神經(jīng)遞質(zhì)［3-4］，由膽堿和乙酰輔酶A為原料在膽堿乙酰移位酶(膽堿乙?；窩hAT)的催化下合成，以囊泡形式釋放，便被膽堿酯酶(AChE)水解為膽堿和乙酸?；浊澳X膽堿能(CBF)神經(jīng)元(主要位于基底核、斜角帶核和內(nèi)側(cè)隔核)合成大量ACh并經(jīng)膽堿能投射纖維輸送至大腦皮層。膽堿能投射功能的退變直接影響皮層的功能［5］，有人認(rèn)為原發(fā)性癡呆，一個(gè)以腦部海馬早期損害逐漸延伸全腦的神經(jīng)退行性疾病，存在嚴(yán)重的膽堿能系統(tǒng)功能退變，ChAT異常表達(dá)導(dǎo)致ACh合成障礙，使神經(jīng)傳導(dǎo)缺乏必要的膽堿能遞質(zhì)，從而影響學(xué)習(xí)和記憶［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)［7］，以大腦損害為主的血管性癡呆患者也存在認(rèn)知功能障礙，程度與ACh合成減少和 AChE活性相對(duì)增高、ChAT活性降低有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，甲減組大鼠額葉內(nèi)乙酰膽堿含量較健康對(duì)照組減少，有研究［8］發(fā)現(xiàn)成年期甲減大鼠腦組織內(nèi)乙酰膽堿含量減少，與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。膽堿能神經(jīng)元受損引起的腦組織ACh含量減少，可能是學(xué)習(xí)、記憶能力下降的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)甲減大鼠Ach含量減少，提示腦內(nèi)甲狀腺激素系統(tǒng)可能通過乙酰膽堿系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)于學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)作用。

給予甲減大鼠替代治療2周，甲減大鼠血清甲狀腺激素恢復(fù)至正常水平時(shí)，額葉內(nèi)乙酰膽堿含量恢復(fù)正常。提示甲狀腺激素可以影響膽堿能系統(tǒng)，其具體機(jī)制不清，有報(bào)道認(rèn)為甲狀腺激素影響Ach的代謝［9］。

本實(shí)驗(yàn)提示成年期甲減大鼠額葉內(nèi)乙酰膽堿含量較健康對(duì)照組降低，經(jīng)替代治療能使乙酰膽堿含量恢復(fù)正常水平，提示甲狀腺激素與Ach及膽堿能神經(jīng)通路有著密切的聯(lián)系，共同維持膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的平衡，影響認(rèn)知功能。

［1］時(shí)美琴，楊昊，朱德發(fā)，等.原發(fā)性甲狀腺功能減退癥對(duì)記憶功能的影響［J］.中國(guó)臨床保健雜志，2008，11(5):449－450.

［2］楊會(huì)宣，王文學(xué)，柯金水，等.堿性羥胺比色法測(cè)定全血乙酰膽堿［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，1995，13(3):125-129.

［3］DeNicola AF，Labombarda F，Deniselle MC，et al.Progesterone neuroprotection in traumatic CNS injury and motoneuron degeneration［J］.Front Neuroendocrinol，2009，30(2):173-187.

［4］Djebaili M，Guo Q，Pettus EH，et al.The neurosteroids progesterone and allopregnanolone reduce cell death，gliosis，and functional deficits after traumatic brain injury in rats［J］.J Neurotrauma ，2005，22(1):106-118.

［5］Ridley RM，Baker HF，Leowdyke A，et al.Further analysis of the effects of immunotoxic lesions of the basal nucleus of Meynert reveals substantial impairment on visual discrimination learning in monkeys［J］.Brain Res Bull，2005，65(5):433-442.

［6］耿勁松，周愛玲，胡亞娥，等.腦益康對(duì)阿爾茨海默病大鼠中樞膽堿能系統(tǒng)酶的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，l9(7):1619-1621.

［7］Jia JP，Jia JM，Zhou WD，et al.Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebros pinalfluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular dementia［J］.Chin Med J，2004，117(8):1161-1164.

［8］李永軍，王群，陸兵勛.成年甲減大鼠認(rèn)知行為及其機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志，2008，5(7):577-579.

［9］Smith JW，Evans AT，Costall B，et al.Thyroid hormones，brain function and cognition:a brief review［J］.Neurosci Biobehav Rev，2002，26(1):45-60.