KISS-1和MMP-9在51例鼻咽鱗狀細胞癌中的表達和臨床意義

唐立濱,宋旭東

(1.河北省唐山市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 063001;2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院病理科,河北唐山063000)

運用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)法檢測KISS-1和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在鼻咽癌組織中的表達狀況及二者間的相互作用,探討KISS-1和MMP-9對鼻咽癌生物學(xué)行為的影響,揭示鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移的形成機制,為臨床診治及預(yù)后判斷提供理論依據(jù),現(xiàn)將鼻咽癌標本51例及鼻咽慢性炎癥組織30例的分析結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇1999年 1月至 2006年3月在唐山市人民醫(yī)院初次診斷并手術(shù)切除的鼻咽癌石蠟標本51例。所有標本術(shù)前均未經(jīng)任何放療、化療和其他抗腫瘤治療。所有鼻咽癌標本參照1992年福州鼻咽癌TNM分期標準進行分期。其中男38例,女 13例;年齡 23～ 76歲,平均46歲,其中,≤40歲10例,＞40～60歲 26例,＞60歲 15例;病理診斷鼻咽低分化鱗狀細胞癌48例,鼻咽高分化鱗狀細胞癌3例;頸淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移組32例,頸淋巴結(jié)陰性轉(zhuǎn)移組19例;臨床分期中Ⅰ～Ⅱ期12例,Ⅲ～Ⅳ期39例。另外取鼻咽部病理活檢證實為鼻咽慢性炎癥組織標本30例作對照組。

1.2 試劑及儀器 鼠抗人單克隆KISS-1抗體原液(美國鳳凰藥業(yè)有限公司),鼠抗人單克隆MMP-9抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司),CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))。采用即用型SP免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。

1.3 試驗方法 病理置10%中性緩沖甲醛溶液中固定。經(jīng)標準乙醇梯度脫水,二甲苯透明2次,浸蠟包埋。每個石蠟包埋的病理組織以切片機制備成4μ m厚的切片,連續(xù)切片3張,再脫蠟至水。其中1張行HE染色,另外2張分別做KISS-1、MMP-9免疫組織化學(xué)染色。

1.4 判定標準 運用雙盲法進行交叉閱片并記錄。免疫組織化學(xué)染色顯示KISS-1、MMP-9標志物主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達,部分在細胞核內(nèi)表達,呈棕黃色細顆粒。染色結(jié)果以著色強度高于背景者判定為陽性。利用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),為減少人為的影響,以免疫組織化學(xué)記分值作為陽性的評判標準。記分值的算式為:H=N×IN代表隨機觀察的10個高倍鏡視野中的平均陽性細胞數(shù),然后按陽性細胞的百分比統(tǒng)計記分。陽性細胞數(shù)記分(N):0分:＜10%,1分:≥10%～30%,2分:≥30%～60%,3分:≥60%～75%,4分:≥75%。I代表著色強度記分值。1分:弱(+,淡黃色),2分:中等(++,棕黃色),3分:強(+++,深棕黃色)。顯色強度與背景無明顯差別者為陰性。若H＞1為陽性,若H≤1則為陰性。0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽性(+),4～6分為中等陽性(++),6分以上為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以±s表示。組間比較采用χ2檢驗,P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

KISS-1、MMP-9在鼻咽癌及鼻咽部炎癥組織中的表達結(jié)果見表1,插Ⅲ圖1、2。在各臨床病理中的變化見表2。

表1 KISS-1、MMP-9在鼻咽癌及鼻咽部炎癥組織中的表達

表2 KISS-1與M MP-9在各臨床病理分組間的陽性表達率

3 討 論

1996年,Lee和Welch[1]運用微細胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移法(micro cell mediated chromosome transfer,MMCT)發(fā)現(xiàn)了KISS-1基因。通過Northern Blot試驗證實,在正常的心、腦、肝、肺和骨骼肌組織中可檢測到該基因的表達[2],在腎臟和胰腺中微弱表達,而胎盤組織中高表達。Ohtaki等[3]研究發(fā)現(xiàn),KISS-1編碼的蛋白質(zhì)羧基末端(61～121)的54個氨基酸還是人孤兒 G蛋白偶聯(lián)受體(命名為 hOT7T175、GPR54或AXOR12)的天然配體,而被命名為轉(zhuǎn)移抑素(metastin)。

MMP-9(明膠酶 B)是 MMPs家族中的重要成員,相對分子質(zhì)量為M r 92×103,它可由結(jié)締組織細胞、巨噬細胞或腫瘤細胞分泌,是降解Ⅳ型膠原最主要的酶,在生理情況下維持細胞外基質(zhì)、在胚胎發(fā)育、組織塑形中起著不可替代的作用[4]。王軍等[5]等研究發(fā)現(xiàn),MMP-9在鼻咽癌組織表達率明顯高于正常組織。而且,MM P-9在鼻咽癌組織中的高表達與臨床病理分期有關(guān),伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達率差異也具有顯著性。有研究顯示,MMP-9蛋白的表達與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[6-7]。相同的結(jié)論在胸部腫瘤、腸道腫瘤及骨肉瘤中得到證實[8-9]。張欣欣等[10]認為鼻咽癌組織中MM P-9蛋白高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),可能與鼻咽癌起源于上皮組織,主要經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移而非血道轉(zhuǎn)移的機制相吻合。

?；蹚┑萚11]研究發(fā)現(xiàn),不同生長時期的異位內(nèi)膜組織其KISS-1基因和MM P-9基因的表達不同。在異位病灶形成過程中,KISS-1基因的表達受到抑制,使異位內(nèi)膜具有更強的侵襲能力,更容易種植生長,這與轉(zhuǎn)移性腫瘤中KISS-1基因表達缺失或降低的結(jié)果一致[12-13]。同時KISS-1弱表達削弱了對MMP-9基因表達的抑制作用,使MMP-9表達升高,異位內(nèi)膜組織水解能力增強,異位內(nèi)膜周圍的基底膜被降解,進一步促進異位內(nèi)膜種植生長,并不斷增大。

2001年,Yan等[14]發(fā)現(xiàn),在6個MM P-9 mRNA陽性細胞系中無KISS-1 mRNA表達。有研究發(fā)現(xiàn),與單純轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3的對照組相比,轉(zhuǎn)染KISS-1基因的HT1080細胞中MMP-9 mRNA的合成速率明顯降低。由佛波酯(PMA)和腫瘤壞死因子α(TNFα)各自激活FRKs基因和 JNFs基因會上調(diào)MMP-9表達,而不受 KISS-1影響,說明 KISS-1作用于靶點并非通過蛋白激酶(MAPK)途徑。其研究證明,KISS-1并未影響 AP-1、Sp1和 FTs等轉(zhuǎn)錄因子與M MP-9啟動子結(jié)合,而是抑制 NF-κ B與MMP-9啟動子結(jié)合使后者表達降低。靜息狀態(tài)下 NF-κ B 與抑制蛋白 I κ Bα、Iκ Bβ 結(jié)合,以無活性狀態(tài)存在細胞質(zhì)內(nèi),胞外多種刺激可活化 Iκ B激酶,使 Iκ B磷酸化后降解,NF-κ B隨即活化進入核內(nèi)和相應(yīng)DNA序列結(jié)合,發(fā)揮對基因轉(zhuǎn)錄、表達控制的作用。KISS-1就是通過使HF1080細胞中 Iκ B含量增加而封鎖了 NF-κ B向核內(nèi)遷移,使 NF-κ B與MMP-9啟動子結(jié)合減少導(dǎo)致M MPmRNA穩(wěn)定水平下降,合成速率顯著降低。

本研究發(fā)現(xiàn),在鼻咽癌組織中,KISS-1存在表達,且與MMP-9表達狀態(tài)統(tǒng)計分析二者差異有顯著性,成反向表達。這和前人做的相關(guān)實驗相吻合[11]。因此,同時檢測腫瘤組織中KISS-1與 MMP-9的表達,如出現(xiàn)MMP-9呈高表達、KISS-1低表達,提示遠處轉(zhuǎn)移的可能性大,建議臨床醫(yī)師盡早做出相應(yīng)的檢查,充分評估患者的臨床分期,并制定相應(yīng)的治療方案。

總之,通過本實驗揭示了KISS-1和M MP-9對鼻咽癌生物活性的影響,進一步證實KISS-1蛋白表達降低、MMP-9表達升高將有助于鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和擴散,同時檢測二者的表達狀況可指導(dǎo)臨床及時有效地采取相應(yīng)的檢查和治療,為評判臨床預(yù)后提供切實可行的觀測指標。

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