降鈣素對(duì)去卵巢大鼠椎間盤退變的影響

王文雅,張 柳,王哲彥,苗家園,程 潭,田發(fā)明

(河北聯(lián)合大學(xué):1.病理教研室;2.附屬醫(yī)院骨科,河北唐山063000)

骨關(guān)節(jié)退變(osteoarthrosis,OA)和骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是中老年人群特別是絕經(jīng)后女性的常見疾病。有研究表明,絕經(jīng)后OP患者脊柱易于發(fā)生退變[1-2],去卵巢大鼠在骨量減少的同時(shí)發(fā)生腰椎間盤退變[3-4]。當(dāng)椎間盤發(fā)生退變時(shí),I型膠原(collagen tryeⅠ,COLⅠ)含量逐漸增加,髓核中Ⅱ型膠原(collagen tryeⅡ,COLⅡ)的含量減少并出現(xiàn)COL I,此改變與椎間盤退變程度呈正相關(guān)[5]。降鈣素(calcitonin)是一種公認(rèn)的抗骨吸收劑,長期以來一直被用來治療骨質(zhì)疏松[6]。有研究證實(shí),CT可以延緩去卵巢大鼠腰椎間盤的退變[4],但具體的分子作用機(jī)制尚未明確?，F(xiàn)將降鈣素對(duì)去卵巢大鼠的療效報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選擇 3月齡健康 1級(jí)大鼠(Sprague Dawley,SD)50只(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量(210±32)g。隨機(jī)分為 5組,每組10只,Sham8組、Sham20組分別為假手術(shù)8、20周,OVX8組、OVX20組為卵巢切除 8、20周,降鈣素組為卵巢切除加降鈣素。

1.2 模型制備 在室溫20℃自然光照的動(dòng)物房中飼養(yǎng)(自由飲食)1周。Sham8組和Sham20組的大鼠暴露卵巢但不切除。給予等劑量生理鹽水皮下注射,分別于8、20周后脫頸處死取椎體。OVX8組和OVX20組手術(shù)切除卵巢后3 d內(nèi),每日1次肌注青霉素20萬U/只,8、20周后處死大鼠取椎體。降鈣素組術(shù)后8周開始給予20 U/kg降鈣素隔日皮下注射,20周處死取椎體。

1.3 標(biāo)本收集及處理 按上述時(shí)段脫頸處死大鼠。切開大鼠背部皮膚,銳刀分離所有的軟組織,切除棘突、橫突等附件組織,切取 L2～4椎體測量骨密度,L4～5椎間盤置于 10%中性甲醛緩沖液中準(zhǔn)備蘇木素-伊紅(HE)染色、甲苯胺藍(lán)染色及免疫組化。L4～5用慢速鋸在近端沿矢狀面剖開骨髓腔一小部分,固定完成后,經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH=7.4,4℃)脫鈣,每7天更換脫鈣液,鑒定脫鈣情況以大頭針刺入無阻力為適宜標(biāo)準(zhǔn),表明脫鈣完全。將標(biāo)本依次脫水、透明、浸蠟、包埋,沿正中矢狀面作5 μ m連續(xù)切片用于HE染色、甲苯胺藍(lán)染色及COLⅡ免疫組化染色。甲苯胺藍(lán)染色:組織常規(guī)脫蠟至水,水洗5 min。入甲苯胺藍(lán)染色液5～20 min。95%的乙醇速洗2次,每次10下。入純乙醇2次,每次 1分鐘。透明,樹膠封固。本染色使酸性黏多糖和糖蛋白染成紫紅色或淺藍(lán)色,以觀察其在椎間盤中的分布及表達(dá)。免疫組化染色(SP法):石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。(1)復(fù)合消化酶室溫下抗原修復(fù)15 min。(2)滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑。(3)滴加正常非免疫動(dòng)物血清。(4)滴加一抗(1∶100),4℃冰箱過夜。(5)滴加生物素標(biāo)記的二抗。(6)滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液。(7)DAB顯色。(8)蘇木素復(fù)染。(9)中性樹膠封固。每次實(shí)驗(yàn)均以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。利用半定量方法測定平均灰度值。

1.4 骨密度檢測 應(yīng)用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀(DEXA,美國),采用小物體掃描模式,準(zhǔn)確度 0.01%,掃描速度60 mm/s,分辨率1.0 mm×1.0 mm,掃描寬度5.0 cm的參數(shù)值,進(jìn)行L2～4腰椎整體骨密度的測量。為了評(píng)價(jià)精確度,隨機(jī)選取1例,在位置不變的情況下,連續(xù)測量 tBMD 5次。精確度用變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

骨密度的CV值為0.51%。Sham8組、OVX8組、Sham20組、OVX20組和降鈣素組骨密度值分別為(0.153 8±0.014)、(0.140 8±0.021)、(0.142 5±0.011)、(0.125 3±0.009)和(0.140 1±0.008)。OVX8和OVX20組大鼠的骨密度分別與Sham8和Sham20組比較,顯著降低(P＜0.05);降鈣素組大鼠的骨密度與OVX20組比較,顯著增加(P＜0.05)。椎間盤的組織學(xué)表現(xiàn)及退變程度見插Ⅱ圖 1、2。COLⅡ在椎間盤3個(gè)組成部分中皆有表達(dá),且表達(dá)趨勢一致:OVX8組和OVX20組分別與Sham8組和Sham20組比較,COLⅡ陽性表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05);降鈣素組與OVX20組比較,COLⅡ陽性表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05),但仍低于Sham20組(插Ⅱ圖3,插Ⅲ圖4、5)。見表1。

表1 ICOLⅡ免疫組織化學(xué)染色積分吸光度(±s,n=10)

表1 ICOLⅡ免疫組織化學(xué)染色積分吸光度(±s,n=10)

#:P＜0.05,與OVX8組比較;&:P＜0.05,與OVX20組比較;※:P＜0.05,與Sham20組比較。

組別 終板 髓核 纖維環(huán)Sham8組 220.291±15.545# 210.161±15.368# 225.703±14.214#OVX8組 196.273±17.326 197.811±14.634 187.647±15.372 Sham20組 210.516±16.324& 205.901±13.563& 218.902±17.238&OVX20組 143.634±16.495 131.511±17.439 151.326±14.351降鈣素組 179.812±14.275&※ 178.402±15.387&※177.319±16.422&※

3 討 論

卵巢切除大鼠是一個(gè)模仿人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[7-8]的公認(rèn)模型。有研究發(fā)現(xiàn),成年大鼠卵巢切除后,由于雌激素缺乏使骨改建呈高轉(zhuǎn)換型,骨吸收和骨形成均增高,但骨吸收大于骨形成,骨形成相對(duì)減少,骨改建呈負(fù)平衡。本實(shí)驗(yàn)OVX8組采用3月齡成熟大鼠卵巢切除,大鼠腰椎骨密度顯著下降。

椎間盤退變作為與年齡相關(guān)的退行性病變之一[9],與同為中老年高發(fā)疾病的骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系尚存爭議。有研究發(fā)現(xiàn),骨量丟失明顯的絕經(jīng)后女性椎間盤退變程度也更為嚴(yán)重,椎體骨量丟失很可能是椎間盤退變的病因之一[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn),OVX組大鼠不僅表現(xiàn)為椎體骨量下降,椎體骨密度顯著低于Sham組大鼠,而且椎間盤發(fā)生明顯退變。雌激素水平的降低不僅可以提高骨轉(zhuǎn)換水平并使骨代謝平衡傾向于骨丟失,同時(shí)其對(duì)炎性因子的活性和功能的抑制作用亦隨之減弱,這很可能是去卵巢大鼠發(fā)生椎間盤退變的病理因素之一[6]。此外,因雌激素缺乏引起的椎體和軟骨終板骨量變化進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)環(huán)境改變可能是去卵巢大鼠發(fā)生椎間盤退變的另一主要病理因素。目前,對(duì)降鈣素的研究仍以其對(duì)骨代謝的影響為主,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊布性趯?duì)破骨細(xì)胞的作用。近年來,有研究表明,降鈣素具有保護(hù)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì),抑制關(guān)節(jié)軟骨退變的作用[12-17]。

本研究中,OVX8組和OVX20組大鼠除椎體骨量下降外,腰椎間盤發(fā)生嚴(yán)重退變,降鈣素組大鼠也呈現(xiàn)一定程度的椎間盤退變,但程度明顯減輕。這表明降鈣素治療不僅能夠延緩OVX大鼠骨量丟失,也有助于延緩其腰椎間盤退變。本研究推測,其機(jī)制不僅與降鈣素對(duì)骨代謝的作用有關(guān),也很可能與其對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。

細(xì)胞外基質(zhì)成分的丟失和軟骨終板的鈣化均為椎間盤退變的病理改變[17],椎間盤中細(xì)胞外基質(zhì)成分主要包括蛋白多糖和膠原蛋白。退變椎間盤中膠原總量變化不明顯,但膠原類型及分布發(fā)生很大的變化[18],在Sham8、Sham20組軟骨終板,髓核及內(nèi)層纖維環(huán)中COLⅡ的含量高,隨椎間盤退變程度的加重,OVX8組OVX20組軟骨細(xì)胞生成的COLⅡ明顯減少。甲苯胺藍(lán)染色各組椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖含量與COLⅡ的表達(dá)具有相同的趨勢。而基于降鈣素對(duì)軟骨細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)的保護(hù)作用以及椎間盤、軟骨終板的細(xì)胞和基質(zhì)成分與其他部位尤其是關(guān)節(jié)軟骨的成分相近,本研究推測,降鈣素對(duì)去卵巢大鼠腰椎間盤退變的抑制作用,不僅與其抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換維持椎體骨量及其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善椎間盤組織的生物力學(xué)環(huán)境有關(guān),還可能與其保護(hù)椎間盤軟骨尤其是抑制軟骨終板的鈣化及保護(hù)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān),但這些推測還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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