同體非血管化游離骨移植中骨形成的實(shí)驗(yàn)研究

尹祿，潘慧，韓澤民，劉寶林

自體骨移植是修復(fù)頜骨缺損的主要手段之一。在血管化和非血管化游離骨移植修復(fù)頜骨缺損的比較中，非血管化骨移植在臨床應(yīng)用中有著自己的特點(diǎn)和一定優(yōu)勢，并已成功地應(yīng)用到臨床實(shí)踐中。非血管化游離移植骨塊在體內(nèi)的改建問題，國內(nèi)外各家的報(bào)道存在著不盡相同的觀點(diǎn)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同離體時(shí)間點(diǎn)的非血管化游離骨塊植入體內(nèi)后的細(xì)胞成活和成骨情況，探討非血管化游離骨塊的離體時(shí)間與植入體內(nèi)后骨成活之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 天津地區(qū)成年雜種狗8只，體重18～25 kg，雌雄不限。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃閮山M，A組為離體40 min實(shí)驗(yàn)組，B組為離體120 min實(shí)驗(yàn)組。全麻藥為蘇眠新Ⅱ(長春獸醫(yī)研究所)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用手術(shù)器械。骨折固定用金屬鈦板(西安中邦鈦生物材料公司)。甲酸、多聚甲醛、PBS緩沖液、APES(3-aminopropyl-Triethoxysilane)：Sigma公司。組織學(xué)HE染色和改良Mallory染色的相關(guān)試劑。光學(xué)顯微鏡：Olympus。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 全身麻醉下拔除狗的下頜前磨牙，縫合拔牙床牙齦黏膜，在拔牙術(shù)后1個(gè)月，牙齦黏膜可以達(dá)到組織上的愈合，在截除下頜骨分離時(shí)不易穿通口腔。取下頜骨下緣切口，在拔牙區(qū)節(jié)段性截除下頜骨長約3.0 cm的骨段。取對(duì)側(cè)包括髂前上嵴的髂骨全層骨段，長度略大于3.0 cm，去除附著于骨上的肌腱等軟組織；分別在離體40 min、120 min內(nèi)植入下頜骨缺損的受植區(qū)。成型板和小鈦板固定，生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，嚴(yán)密縫合術(shù)區(qū)切口。

1.3 標(biāo)本處理及檢測方法 A、B兩組動(dòng)物均在種植體植入術(shù)后4周和8周取出原植入的髂骨塊，X線檢查骨吸收及種植體位置情況。用金剛砂片沿種植體長軸縱向剖開骨質(zhì)后，觀察大體標(biāo)本，比較兩組標(biāo)本的差別。取材厚度為5.0 mm，4%多聚甲醛固定，蔣氏固定和脫鈣液進(jìn)行組織脫鈣[4]，脫水后，石蠟包埋。石蠟切片厚8 μm，做HE和蔣氏改良Mallory法染色，觀察骨塊內(nèi)細(xì)胞和新骨形成情況。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 骨移植術(shù)后4周，A組動(dòng)物植骨塊與下頜骨缺損處兩斷端間有輕度的活動(dòng)度，可見骨痂形成，接觸端成凸起狀，硬度較小，手術(shù)刀可切開；外層有較多的軟組織包繞，易出血、易剝離。B組植骨塊與下頜骨缺損處的兩斷端間未見明顯骨痂形成，外層包繞的軟組織較少。

骨移植術(shù)后8周，A組植骨塊與下頜骨缺損處已連成一體，連接處稍凹，略低于兩側(cè)的骨面，兩斷端間無動(dòng)度，手術(shù)刀切不開；外層包繞的軟組織少而致密，從骨面不易剝離。B組植骨塊與下頜骨缺損處的連接處可見少量骨痂形成，手術(shù)刀可切開，植骨塊有輕度的動(dòng)度，有明顯吸收；外層包繞的軟組織較多，易出血，也容易剝離。

X線檢查，A組植骨塊吸收較少，骨吸收主要集中在植骨塊的下緣，B組骨塊明顯吸收。

2.2 組織學(xué)觀察 A組在術(shù)后4周和8周，移植骨塊內(nèi)均可見成活的骨細(xì)胞，骨陷窩內(nèi)有細(xì)胞核，偶見多核的破骨細(xì)胞(圖1)；術(shù)后8周能見到低密度的新骨形成，有些部位還可以見到數(shù)目不等島狀軟骨和軟骨向編織骨過渡的現(xiàn)象(圖2)。B組術(shù)后4周和8周，移植骨塊內(nèi)均未見到成活的骨細(xì)胞，骨陷窩內(nèi)空虛，多核的破骨細(xì)胞常見，圖象顯示為死骨，無新骨形成現(xiàn)象，也沒有見到軟骨的形成(圖3)。

圖1 A組HE染色(200×)

圖2 A組改良Mallory法染色(100×)

圖3 B組HE染色(200×)

3 討論

自體非血管化游離骨移植是目前臨床上修復(fù)頜骨缺損的主要方法之一[5-6]。一百多年來，對(duì)于大塊骨缺損修復(fù)時(shí)骨塊成活及成骨能力的研究，使得自體非血管化游離移植骨的歸宿成為人們最為關(guān)注的問題。單純非血管化的游離骨移植后骨塊的組織學(xué)變化最開始被描述為“爬行替代”[1]。因此，不少人認(rèn)為非血管化游離骨塊植入體內(nèi)后是死骨，沒有成骨能力，只能作為新骨形成的支架。骨缺損修復(fù)過程是植入的非血管化游離骨塊逐漸被吸收，其修復(fù)的骨缺損空間則由植入床周圍組織形成的新骨替代，是“爬行替代”學(xué)說的核心理論。以往的研究對(duì)非血管化游離骨塊離體時(shí)間的因素考慮較少。

近年來臨床實(shí)踐中遇到的一些現(xiàn)象對(duì)該理論提出了挑戰(zhàn)。劉寶林等在非血管化游離骨移植同期植入種植體修復(fù)下頜骨缺損的病例中發(fā)現(xiàn)，離體時(shí)間與種植體的骨結(jié)合成功率有著密切聯(lián)系[7]。牙種植成功的關(guān)鍵是種植體與骨形成良好的結(jié)合，有生命活力和正常新陳代謝的骨有利于種植體形成骨結(jié)合。因此推測非血管化游離移植骨塊是否成活對(duì)同期植入種植體與骨組織能否形成結(jié)合至關(guān)重要。

Stroud等認(rèn)為，在新骨形成中有3個(gè)作用：骨引導(dǎo)、骨誘導(dǎo)及提供成骨細(xì)胞[8]。

骨傳導(dǎo)：一方面由破骨細(xì)胞吸收壞死的植骨塊，另一方面由宿主骨床的骨外膜、骨內(nèi)膜、骨髓和周圍的軟組織向壞死的植骨塊內(nèi)長入血管間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，產(chǎn)生軟骨和骨組織以取代壞死骨而使植骨塊愈合。因此植骨塊的主要作用是起支架作用，以利宿主骨床血管和骨系細(xì)胞的長入。從骨引導(dǎo)作用來看，雙端受植床有利于植骨塊的愈合及盡快完成骨的改建和重建[9]。

骨誘導(dǎo)指移植骨刺激周圍由宿主來的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，形成新骨。單純骨移植的誘導(dǎo)成骨發(fā)生在整個(gè)移植區(qū)。

提供成骨細(xì)胞：營養(yǎng)物質(zhì)通過小管滲入到移植骨，可使部分成骨細(xì)胞存活一定時(shí)間。臨床上剝離骨膜時(shí)僅纖維層被剝離，由成骨細(xì)胞組成的生發(fā)層仍然附著在骨皮質(zhì)表面，只要骨保持濕潤，或體外不超過2 h，成骨細(xì)胞仍可存活。骨內(nèi)膜表面細(xì)胞也有一層相同的成骨細(xì)胞，可成活并形成新骨[10]。Craig在定量研究密質(zhì)骨不同細(xì)胞在成骨中的作用后指出，在前4周，新骨形成主要來自移植骨細(xì)胞，而在4周后新骨形成主要來自宿主骨[11]。由此看來，移植骨內(nèi)可以有部分細(xì)胞成活，并具有成骨能力。

本研究對(duì)狗下頜骨長度為3.0 cm的節(jié)段性缺損用游離非血管化髂骨修復(fù)，在游離骨塊離體40 min內(nèi)植入受區(qū)，骨斷端間行堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定，在體內(nèi)4至8周的時(shí)間內(nèi)，骨連接處先形成骨痂，表明植骨塊有骨誘導(dǎo)能力；以后骨痂改建形成骨性連接，移植骨塊周圍形成新骨，可能表明骨塊內(nèi)有活骨細(xì)胞的存在，并有一定的骨形成能力。移植骨塊內(nèi)中心部位多個(gè)島狀的軟骨細(xì)胞群推測是植骨塊內(nèi)松質(zhì)骨的細(xì)胞形成的，因?yàn)槿绻菑闹車佬衼淼募?xì)胞，它們應(yīng)該從植骨塊的周邊逐漸向中心形成。移植骨塊內(nèi)軟骨的形成是非血管化游離骨塊移入體內(nèi)成活的有力證據(jù)。

骨塊成活量的多少取決于它的營養(yǎng)狀況。在較短的離體時(shí)間內(nèi)，骨內(nèi)的各種細(xì)胞可以靠自身營養(yǎng)儲(chǔ)備和對(duì)缺氧的耐受程度來維持活力。由于每種細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性不同，在不同的離體時(shí)間點(diǎn)，骨塊內(nèi)活細(xì)胞的成分不盡相同，一般來說，同一組織類型的細(xì)胞，功能狀態(tài)活躍和正處于分化狀態(tài)的幼稚細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性較低，功能活躍的細(xì)胞維持著組織器官的正常形態(tài)和功能，幼稚細(xì)胞是組織更新的來源，這些細(xì)胞死亡意味著組織在移植一定時(shí)間后，分化成熟的功能狀態(tài)細(xì)胞完成其使命后，慢慢被機(jī)體清除；由于沒有新生組織的替補(bǔ)，移植物會(huì)逐漸老化、死亡，直至完全被其他組織替代。這種現(xiàn)象可能是“爬行替代”理論形成的基礎(chǔ)。

“爬行替代”理論認(rèn)為，移植骨多在1周后開始吸收，周圍的破骨細(xì)胞逐漸蠶食、破骨、吸收，清除死骨；3周時(shí)有骨改建，即新骨的形成。果真如此的話，早期的破骨細(xì)胞應(yīng)該在死骨的邊緣，新骨的形成在破骨細(xì)胞的后面。我們的實(shí)驗(yàn)在骨連接的界面處并沒發(fā)現(xiàn)大量的破骨細(xì)胞，而是炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，也有少量的破骨細(xì)胞；而在死骨內(nèi)可以見到數(shù)量不少的破骨細(xì)胞，這些破骨細(xì)胞可能由骨塊內(nèi)的其他有活力的細(xì)胞分化而來。這些細(xì)胞的出現(xiàn)提示，非血管化游離骨塊的營養(yǎng)狀況決定著幼稚骨細(xì)胞的分化方向：營養(yǎng)充足的骨塊，比較原始的細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，形成新骨并維持一定的形態(tài)以行使其相應(yīng)功能；營養(yǎng)差的骨塊，活力差，機(jī)械強(qiáng)度小，不利于承擔(dān)重力，原始細(xì)胞向破骨細(xì)胞方向分化，以清除該骨，待由新骨替代。死骨的形成不完全是骨塊內(nèi)細(xì)胞立即死亡，部分成熟的骨細(xì)胞可能還存在一定的活力和功能，但其老化后，沒有新的骨細(xì)胞補(bǔ)充，骨塊也就沒有了活力。這也是死骨在一定時(shí)間以后才能出現(xiàn)相應(yīng)體征的原因。

非血管化游離髂骨移植的成活可能與髂骨富有松質(zhì)骨成分的特性有關(guān)。①松質(zhì)骨富于未分化的多潛能細(xì)胞，這些細(xì)胞在短暫離體缺血的情況下可能分泌某些促血管形成的因子，易于早期建立營養(yǎng)通道；②松質(zhì)骨多孔隙的特點(diǎn)有利于周圍營養(yǎng)物質(zhì)滲透和營養(yǎng)通道再通。非血管化游離骨移植時(shí)離體時(shí)間短，缺血缺氧時(shí)間短，骨塊內(nèi)的細(xì)胞更可能保持活力和功能狀態(tài)。離體時(shí)間對(duì)移植骨成活狀況有著決定性的影響。

本實(shí)驗(yàn)以天津地區(qū)的成年健康雜種狗為研究對(duì)象，揭示了非血管化游離骨移植時(shí)的離體時(shí)間與骨塊內(nèi)細(xì)胞成活密切相關(guān)的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)設(shè)定了條件，其結(jié)果有一定的局限性，因此還需要更多種屬的動(dòng)物、更長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果來反復(fù)驗(yàn)證。與非血管化游離骨移植細(xì)胞成活相關(guān)的營養(yǎng)通道重建問題還有待于進(jìn)一步研究。

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