慢性丙型肝炎患者IL-28B基因多態(tài)性檢測及臨床應用

王永忠，嚴 桐，朱 珍，葉春艷，周勝生，芮冬妹，申紅玉，柳龍根

(常州市第三人民醫(yī)院，江蘇常州213001)

聚乙二醇干擾素(PEG-IFN-α)聯(lián)合利巴韋林(RBV)是目前治療丙型肝炎病毒(HCV)感染的標準模式。最新研究表明，白細胞介素28B(IL-28B)基因多態(tài)性與PEG-IFN-α和RBV聯(lián)合治療效果具有較高的相關性［1～3］。我們對42例接受PEG-IFN-α和RBV聯(lián)合治療的慢性丙型肝炎患者IL-28B基因區(qū)rs12980275、rs12979860、rs8099917的多態(tài)性進行了檢測分析。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2011年3月我院收治的42例慢性丙型肝炎患者，均接受180 μg/周PEG-IFN-α聯(lián)合RBV治療，診斷及療效判斷標準參照2000年全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案中的標準。其中，男24例、女18例，年齡18～73歲、平均42.5歲;有輸血史33例，吸毒史4例;基因型1b型39例，2a型1例，3b型2例。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針序列 IL-28B基因多態(tài)性檢測試劑盒由上海翼和應用生物技術有限公司提供。引物及探針序列見表1。

1.2.2 檢測方法 DNA提取采用血液基因組提取試劑盒(Qiagen公司)。PCR擴增體系包括10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，300 nmol/L 引物，1.5 U 熱啟動 Taq酶，5 μl DNA 模板，總反應體積50 μl。反應條件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72℃ 60 s，擴增35個循環(huán);72℃延伸10 min。LDR反應體系包括20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，10 mmol/L 二硫蘇糖醇，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L NAD+，12.5 nmol/L探針或引物，3 μl PCR產物，2 U DNA連接酶，總反應體積20 μl。反應條件:95 ℃ 2 min，95 ℃30 s，50℃ 4 min，循環(huán)35次。擴增完成后加入EDTA終止反應。取2.5 μl反應產物與等體積上樣緩沖液混合，然后94℃變性2 min，迅速在冰上冷卻后于ABI Prism 377測序儀上凝膠電泳30 min，采用Genemapper軟件進行分析。

表1 引物及探針序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，基因多態(tài)性與病毒學應合采用Fisher精確檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-28B基因多態(tài)性頻率分布 42例患者rs12979860基因型均為CC型;rs12980275基因型，AA 型 39 例 (92.9%)，AG 型 3 例(7.1%);rs8099917基因型，TT型39例(92.9%)，TG 型3例(7.1%)。

2.2 IL-28B基因多態(tài)性與病毒學應答 42例患者中，快速應答(RVR，治療1個月HCV RNA低于檢測下限)34例，持續(xù)應答(SVR，治療6個月 HCV RNA低于檢測下限)41例，患者均獲得早期應答(EVR，治療3個月HCV RNA下降2個數(shù)量級以上)。不同基因多態(tài)性與PEG-IFN-α和RBV聯(lián)合治療的RVR率有關，與EVR和SVR無關。見表2。

表2 IL-28B基因多態(tài)性與病毒學應答［例(%)］

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者IL-28B基因區(qū)多態(tài)性與PEG-IFN-α聯(lián)合RBV治療效果具有較高的相關性。其中相關性最強的是rs12979860，主要表現(xiàn)為CC型、CT型或TT型，具有CC基因型的患者對標準治療法的SVR率是TT基因型患者的兩倍。不同人群攜帶等位基因C的概率不同，東亞人最高，歐洲人次之，非洲裔美國人最低［1］。Thomas等［2］認為，IL28-B基因多態(tài)性和種族分布有關，東亞人主要表現(xiàn)為CC基因型。本研究42例患者中，rs12979860全部表現(xiàn)為CC基因型，未發(fā)現(xiàn)其他基因型，表明在本地區(qū)rs12979860基因多態(tài)性的特征分布為CC型，不同于以往文獻報道［1～3］?；颊呔@得EVR，41例患者獲得SVR，說明rs12979860基因CC型患者對PEG-IFN-α聯(lián)合RBV治療具有較高的病毒學應答。

Suppiah等［3］發(fā)現(xiàn)，多個核苷酸多態(tài)性和治療結果相關，其中聯(lián)系性最強的是位于IL-28B上游8 kb的一個 SNP-rs8099917，主要表現(xiàn)為 GG、GT或 TT型，且rs8099917基因GG型患者對標準療法的失敗率是GT或TT型患者的2倍。文獻還報道了IL-28B rs12980275、rs7248668和rs11881222多態(tài)性也和療效有關。42例患者中沒有檢測到rs8099917基因型GG，rs8099917基因型主要為TT型，與TG型相比表現(xiàn)出對PEG-IFN-α聯(lián)合RBV治療的PVR作用，但從SVR和EVR作用來看并沒有統(tǒng)計學差異，仍需擴大樣本量進一步分析。

綜上所述，IL-28B基因區(qū)rs12979860、rs8099917單核苷酸多態(tài)性檢測對PEG-IFN-α聯(lián)合RBV治療效果的預測具有一定的作用，值得臨床推廣應用。

［1］Ge D，F(xiàn)ellay J，Thompson AJ，et al.Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance［J］.Nature，2009，461(7262):399-401.

［2］Thomas DL，Thio CL，Martin MP，et al.Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］.Nature，2009，461(7265):798-801.

［3］Suppiah V，Moldovan M，Ahlenstiel G，et al.IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy［J］.Nat Genet，2009，41(10):1100-1104.