散發(fā)性腎母細(xì)胞瘤中DNMT1基因多態(tài)性和1p、16q染色體雜合性缺失的臨床價(jià)值

白 銳，胡曉麗，李艷蕓，趙林勝，耿 鑫，張維銘

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070)

腎母細(xì)胞瘤(WT)是一種源于后腎胚胎組織、由間葉及上皮組織構(gòu)成的惡性腫瘤，臨床伴有多種器官發(fā)育畸形，占兒科腫瘤的87%［1］。DNMT1是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族中的一個重要成員，其N端具有與DNA序列及多種蛋白如DMAP1、DNMT3a結(jié)合的特性，我們推測DNMT1蛋白在此區(qū)段的多態(tài)性可能會影響DNMT1與DMAP1、DNMT3a蛋白的結(jié)合。2010年8月～2011年10月，我們觀察了35例WT患者腎組織DNMT1基因多態(tài)性，并探討了DNMT1基因多態(tài)性及1p、16q染色體雜合缺失(LOH)與WT臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市兒童醫(yī)院病理科確診的散發(fā)性WT患者腎組織35份(觀察組)，男15例、女20例，年齡3個月～5歲;同期選擇該院結(jié)核性、外傷性及尸檢腎組織30份(對照組)，男17例、女13例，年齡5～14歲。所有標(biāo)本未經(jīng)放療、化療治療，經(jīng)石蠟包埋后，參照Biomiga GelDNA Extraction Kit說明提取組織DNA。

1.2 方法

1.2.1 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)分析 SNP位點(diǎn)的選取依據(jù) dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，在被研究區(qū)段內(nèi)選取突變率較高的rs75616428、rs16999593位點(diǎn)，前者基因型為 C/G，后者為T/C。引物由primer3軟件設(shè)計(jì)并由北京華大基因有限公司合成。相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 引物序列長度及退火溫度

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序 用基因擴(kuò)增儀對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為50 μl，其中2×Taq Master Mix 25 μl，高壓滅菌超純水 21 μl，100 mmol/L 上下游引物各 1 μl，基因組 DNA 模板 2 μg。SNP目的片段及內(nèi)參的PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃，退火15 s，兩SNP位點(diǎn)及內(nèi)參的退火溫度及目的片段長度見表1，72℃延伸10 min，重復(fù)34個循環(huán)后于4℃保溫。同步實(shí)施的雙向測序由北京華大基因有限公司完成。

1.2.3 酶切反應(yīng) rs75616428及 rs16999593兩位點(diǎn)內(nèi)切酶的選取依據(jù)NEBcutter2軟件，操作分別依照BmrⅠ及BssSⅠ內(nèi)切酶(Neb，美國)說明嚴(yán)格執(zhí)行。酶切產(chǎn)物由3%瓊脂糖凝膠電泳，其中rs75616428的G基因型的酶切產(chǎn)物長度為150、53 bp，rs16999593的C基因型的酶切產(chǎn)物長度為122、80 bp。

1.2.4 鼠抗DNMT1免疫組織化學(xué) 免疫組化采用二步法，微波熱修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照，分別計(jì)算各組高表達(dá)樣本所占的比例，評判標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)［2］。

1.2.5 1p、16q LOH 分析 依據(jù) Yuan 等［3］的研究，從位于WT內(nèi)1p、16q LOH高頻區(qū)域的大量微衛(wèi)星灶中選取4個微衛(wèi)星灶作為檢測片段，即1p:D1S1469、D1S1676;16q:D16S3050、D16S303。行PCR擴(kuò)增，目的片段及內(nèi)參擴(kuò)增在同一模板濃度及擴(kuò)增條件下進(jìn)行。以聚丙烯酰胺凝膠—銀染法分析LOH結(jié)果，與對照組相比顯色程度降低50%及以上者為未LOH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SHEsis統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡、基因型頻率、等位基因頻率、連鎖不平衡及單倍體分析;率的比較采用χ2檢驗(yàn);連鎖不平衡檢測采用D’值和R2值分析。

2 結(jié)果

2.1 SNP檢測及易感性分析

2.1.1 PCR產(chǎn)物酶切電泳及測序 各位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切后經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離判斷基因型，測序判斷基因型見圖1～3。

圖1 DNMT1基因rs16999593位點(diǎn)測序圖，箭頭示C/C純合子;圖2 DNMT1基因rs16999593位點(diǎn)測序圖，箭頭示C/T雜合子;圖3 DNMT1基因rs75616428位點(diǎn)測序圖，箭頭示C/G雜合子

2.1.2 基因型和等位基因分布比較 經(jīng)SHEsis軟件分析，WT組和對照組等位基因和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。各位點(diǎn)等位基因和基因型分布見表2。

2.1.3 兩位點(diǎn)的單倍型分析 應(yīng)用SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示 rs16999593和rs75616428 一般連鎖(D’=0.496，R2=0.003)，因此考慮構(gòu)建這兩個位點(diǎn)的單倍型進(jìn)行分析。結(jié)果見表3。

表2 DNMT1基因rs16999593位點(diǎn)的基因型和等位基因的分布［例(%)］

表3 rs16999593和rs75616428單倍型分析［例(%)］

2.2 鼠抗DNMT1免疫組織化學(xué) 免疫組化顯示除間質(zhì)細(xì)胞外，DNMT1蛋白120 aa裸區(qū)段在上皮細(xì)胞、胚芽細(xì)胞及間變型WT中均有表達(dá)，與正常腎組織(36.70%)相比，WT組織中 DNMT1蛋白120 aa裸區(qū)段呈強(qiáng)陽性病例所占的比例(48.57%)略升高(P ＞0.05)。

2.3 1p、16q LOH結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)所有樣本在D16S303位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物均為120 bp。1p、16q LOH比例見表4。

表4 WT中1p、16q四檢測位點(diǎn)在不同分期擴(kuò)增量的對比

3 討論

SNP是一種常見的等位基因突變，在人類基因組中平均每500～2 000個堿基對中就有可能存在一個多態(tài)性位點(diǎn)［4］。本實(shí)驗(yàn)中的 rs75616428、rs16999593位點(diǎn)均位于DNMT1的編碼區(qū)，前者可導(dǎo)致H(His)-R(Arg)、后者可致 V(Val)-L(Leu)，由此翻譯生成的DNMT1一級結(jié)構(gòu)可因個別氨基酸通過改變其疏水性或與其他氨基酸形成新的化學(xué)鍵來影響DNMT1的構(gòu)象。本研究中，觀察組兩SNP位點(diǎn)均出現(xiàn)了變異個體，尤其是rs16999593位點(diǎn)的變異率明顯升高。連鎖不平衡及單倍型分析表明，rs75616428、rs16999593位點(diǎn)存在連鎖不平衡，但由于前者C-G變異型比率過低，不足以與rs16999593共同參與致病機(jī)制。

為進(jìn)一步證明DNMT1蛋白這一多態(tài)性對此蛋白與相關(guān)蛋白如DMAP1和/或DNMT3a的影響，我們通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了此未結(jié)合區(qū)段在瘤組織與正常組織中的表達(dá)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)兩組間存在差異。DNMT1蛋白與DNMT3a形成復(fù)合物并參與細(xì)胞分化［5］，而與DMAP1蛋白形成的復(fù)合物可參與雙鏈DNA損傷的修復(fù)［6］，因而與相關(guān)蛋白結(jié)合能力的減弱有可能影響胚胎期腎臟的發(fā)育及腎臟對自身損傷后的修復(fù)能力?；贒NMT1在此區(qū)段還具有結(jié)合DNA的特性，進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于DNMT1多態(tài)性對DNMT1-DNA復(fù)合物形成的影響。

腫瘤伴染色體雜合性缺失在腫瘤生成過程中具有重要作用。大片缺失的染色體片段中包含大量細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)基因如轉(zhuǎn)移浸潤抑制蛋白1p36、消耗性腎結(jié)核病蛋白4 1p36、鈣黏蛋白16 16q22及SLC家族蛋白等，這些蛋白的表達(dá)缺失有可能影響腎臟發(fā)育及腎功能，且已有關(guān)于伴有1p/16q LOH的WT患者，其瘤組織對放化療的敏感性明顯降低［7］的報(bào)道。了解基因多態(tài)性及染色體LOH特性對制定個體化治療方案有重要意義。

綜上所述，我們認(rèn)為DNMT1 rs16999593多態(tài)性可能是WT的發(fā)生危險(xiǎn)因素之一，可作為對WT進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估的一個參考指標(biāo)，同時(shí)1p/16q LOH檢測可作為診斷WT的簡易方法。

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