腦鈉素T381C基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關性

張輝鋒，董平栓，楊旭明，李志娟，馬麗雅

(1河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471000;2甘肅省人民醫(yī)院)

原發(fā)性高血壓(EH)的病因復雜，受環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用。在遺傳易感性方面，由于種群因素和環(huán)境因素的相互作用，導致不同人群及個體中出現(xiàn)易感基因在組合上的差異。隨著對腦鈉素(BNP)生理功能及基因表達調(diào)控的深入研究，影響B(tài)NP代謝途徑的主要基因多態(tài)位點已相繼被證實，但就其啟動子T381C基因多態(tài)性與高血壓病發(fā)生發(fā)展的關系少見報道。本研究選取洛陽地區(qū)漢族人進行了相關研究。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選取2010年6～12月河南科技大學第一附屬醫(yī)院收治的首診EH患者138例(EH組)，男 81 例、女 51 例，年齡(49．28 ±11．19)歲。均符合《中國高血壓防治指南2010》中的診斷標準，其中高血壓1級63例，2級49例，3級26例。排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病、糖尿病及腎功能衰竭者。另擇健康查體者141例作為對照組，男95 例、女46 例，年齡(48．17 ±12．66)歲。無高血壓病家族史，體檢、常規(guī)化驗正常。兩組均為長期生活在當?shù)氐臒o三代以內(nèi)血緣關系的漢族人，兩組年齡、性別具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 BMI、血糖、血脂的檢測 測量受試者的身高、體質(zhì)量、計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。抽取清晨空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)、血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)。血壓連續(xù)測量3次，取平均值作為最后血壓值。

1．2．2 BNP測定 采集清晨空腹靜脈血2 ml，加入EDTA及抑肽酶，離心分離血漿，－20℃保存。應用放免法測定血漿BNP水平，試劑購自New England公司。

1．2．3 PCR方法檢測T381C基因 試劑盒抽提基因組 DNA，上游引物:5'-CTGTGAGTCACCCCGTGCTC-3'，下 游 引 物:5'-GGCAGGAACGCGCTGGAGAC-3'［1］。PCR 體系:10 × PCR Buffer 5 μl，10 mmol/L dNTPS 1 μl，10 μmol/L 的引物各 1 μl，Taq酶 0．5 μl，DNA 模板 4 μl，定容 50 μl。擴增產(chǎn)物為186 bp，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下照相。酶切體系:Hpa Ⅱ內(nèi)切酶 0．5 μl，10 × Buffer 2 μl，PCR 產(chǎn)物 5 μl，定容 15 μl。37 ℃ 水浴 16 h。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下照相。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13．0軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。分析不同基因型與高血壓病分級的關系用χ2檢驗，并結合趨勢性檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 兩組臨床資料 見表1。

2．2 BNP基因T381C位點PCR產(chǎn)物經(jīng)HpaⅡ內(nèi)切酶酶切結果 受檢者DNA經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物為186 bp片段。該片段經(jīng)HpaⅡ內(nèi)切酶識別TT基因型純合子被酶切為139、48 bp兩個片段，CC基因型純合子被酶切為71、68、48 bp三個片段，TC基因型雜合子被酶切后則含有4個片段139、71、68、48 bp。

表1 兩組臨床指標資料

2．3 兩組基因型分布 基因分型表明，兩組BNP基因T381C位點均存在T和C等位基因以及TT純合、CC純合和TC雜合3種基因型，Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，各基因型在EH組和對照組的P 值分別為 0．550、0．992，表明 BNP 基因 T381C 基因型分布頻率達到了遺傳平衡，具有群體代表性。

2．4 兩組基因型與等位基因頻率比較 見表2。

2．5 EH組不同基因型的血壓水平比較 見表3。結果變量為等級有序資料，秩和檢驗χ2=6．489、P=0．039，表明T381C變異對高血壓的分級有影響;結合趨勢相關性檢驗，rs=0．267、P=0．002，表明C等位基因與高血壓的分級呈正相關。

表2 兩組基因型與等位基因頻率比較［例(%)］

表3 EH組不同基因型與血壓分級的相關性［例(%)］

2．6 EH組T381C不同基因型的血漿BNP水平比較 TT、TC、CC基因型患者的血漿BNP水平分別為(193．90 ±43．58)、(141．63 ±36．12)、(89．24 ±24．33)ng/L。相關性分析顯示，C等位基因與BNP水平呈負相關(rs= －0．243，P=0．044)。表明 BNP的381T→C變異影響了血漿BNP水平。

3 討論

研究顯示，EH的發(fā)生與多個基因相關，這些基因的突變、缺失、重排和表達水平的差異，即多個微效基因的聯(lián)合缺陷可能是導致EH發(fā)病的重要原因。根據(jù)對EH發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的不同基因進行研究，可以對EH進行基因診斷和分型，從而為其早期診斷和基因治療提供理論依據(jù)。

人類BNP基因位于染色體1p36．2區(qū)，其編碼含134個氨基酸的prepro-BNP，在體內(nèi)被切去N端的信號肽后成為pro-BNP，之后進一步被酶切為含32個氨基酸的C端BNP，成為有多種心血管作用的活性多肽。這種活性多肽可以拮抗腎素—血管緊張—醛固酮系統(tǒng)，起到利鈉、利尿、擴張血管和抑制交感系統(tǒng)過度興奮的作用。BNP基因第－381附近有數(shù)個可能影響轉錄活性的序列，包括－85位的GATA盒，－9位和－124位的各一個MCAT元件，以及 －111位的 AP-1/CRE樣元件［2］。Landfear等［3］研究發(fā)現(xiàn)，BNP基因T381C多態(tài)性與血清BNP相關，BNP基因變異是導致不同個體間血清BNP水平差異的主要因素。本研究結果顯示，EH組TC+CC基因型和C等位基因頻率均顯著高于對照組，表明C等位基因與EH的發(fā)生有相關性。相關性分析顯示，C等位基因與血漿BNP水平呈負相關;將C等位基因與EH的分級進行分析，結果顯示T381C變異對EH的分級有影響;結合趨勢相關性檢驗分析，發(fā)現(xiàn)C等位基因與EH的分級呈正相關。綜上所述，381C變異可能通過減少體內(nèi)BNP合成而參與了EH的發(fā)病，并對其病情進展起到促進作用。

研究表明，EH 1級患者的BNP水平與正常人相當，EH 2、3級患者BNP水平升高。馬麗雅等［4］報道，EH患者左室肥厚組血漿BNP水平明顯高于無左室肥厚組和正常組，且血漿BNP水平與左室質(zhì)量指數(shù)呈正相關。以上兩項研究也從側面佐證了本研究的結論，即381C變異者通過減少體內(nèi)BNP合成而參與了EH的發(fā)生發(fā)展。BNP主要由心室合成和分泌，長期血壓升高可引起心肌向心性肥厚，導致心室BNP分泌量代償性增加;并且隨著心室肥厚的進展，可能使代償因素掩蓋遺傳因素而導致血漿BNP水平升高。Kapoun等［5］給大鼠心臟灌注BNP發(fā)現(xiàn)，BNP對心臟成纖維細胞DNA合成與細胞增殖有明顯抑制作用，提示BNP可通過旁分泌作用調(diào)控心肌肥厚時成纖維細胞的增殖。但目前還未見應用BNP來干預心室向心性肥厚的研究，這可能與逆轉心室肥厚需要的治療過程較長有關。

BNP基因T381C多態(tài)性的C等位基因的出現(xiàn)頻率存在種族和民族差異，本研究洛陽地區(qū)漢族人T381C多態(tài)性C等位基因在EH和對照組的頻率接近日本人［6］，但較歐洲白種人及美洲哥倫比亞人低［1］。研究洛陽地區(qū)漢族人群BNP基因T381C多態(tài)性與EH及其分級的關系，有助于進一步了解BNP基因T381C多態(tài)性在不同種族中的遺傳異質(zhì)性。

［1］ Meirhaeghe A，Sandhu MS，Mccarthy MI，et al．Association between the T381C polymorphism of the brain natriuretic petide gene and risk of type 2 diabetes in human populations［J］．Hum Mol Genet，2007，16(11):1343-1350．

［2］何峰，宋從周．腦鈉素與心力衰竭的診治［J］．中國心血管雜志，2006，11(3):229-231．

［3］Landfear DE，Stolker JM，Marsh S，et al．Genetic variation in the B-type natriuretic petide pathway affects BNP levels［J］．Cardiovase Drugs Ther，2007，21(1):55-62．

［4］馬麗雅，劉東，張曉雪，等．原發(fā)性高血壓患者血漿腦鈉素水平的變化［J］．中國綜合臨床，2005，21(9):777-778．

［5］Kapoun AM，F(xiàn)aquan L，O’Young G，et al．Funtional opposition to transforming growth factor-β in primary human cardiac fibroblasts:fibrosis myofibroblast conversion，profliferation，and inflammation［J］．Circ Res，2004，94:453-461．

［6］Kajita M，Ezura Y，Iwasaki H，et al．Association of the －381T/C promoter variation of the brain natriuretic peptide gene with low bonemineral density and postmenoausal bone loss［J］．J Hum Genet，2003，48(2):77-81．