養(yǎng)心顆粒對p53基因轉(zhuǎn)染易損斑塊1)家兔模型血清IL-18含量的影響

初少光,劉影哲,周亞濱,孫 靜,王紹堃,楊建飛

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerotic,AS)是一個(gè)多種致病因素導(dǎo)致血管壁發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的慢性炎癥過程,動(dòng)脈內(nèi)皮損傷引起的炎癥反應(yīng)是引起斑塊不穩(wěn)定的主要因素,減輕或消除炎癥反應(yīng)是穩(wěn)定AS易損斑塊的關(guān)鍵。養(yǎng)心顆粒具有益氣養(yǎng)心安神的功效,其具有調(diào)脂、擴(kuò)血管、改善血管內(nèi)皮功能的作用。本課題擬觀察養(yǎng)心顆粒對易損斑塊家兔血清白細(xì)胞介素-18(IL-18)的影響,探討其穩(wěn)定易損斑塊的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 家兔24只,雄性,體重2.3 kg～2.6 kg,4月～5月齡,均購自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,批號SCXK:(HEI)2007003,在通風(fēng)、濕度、溫度適宜的動(dòng)物室內(nèi)單籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物 養(yǎng)心顆粒按古方養(yǎng)心湯藥物組成,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備成養(yǎng)心顆粒;辛伐他汀片(浙江京新藥業(yè)股份有限公司,批號:0908221)。

1.3 儀器與試劑 CR21型低溫高速離心機(jī)(日本日立公司);2.5 mm×15 mm PTCA球囊(日本T ERUMO公司);手推式壓力器(愛爾蘭 MERITMEDICAL公司);6F鞘管(日本TERUMO公司);穿刺針(日本T ERUM O公司);5 F導(dǎo)管(日本TERUMO公司);彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀(美國GE公司);兔IL-18試劑盒(美國 R&D生物技術(shù)公司);中國斑點(diǎn)蝰蛇毒(Chinese Russell's viper Venom,CRVV,廣州蛇毒研究所);組胺(上海卓康生物科技有限公司,批號:070902)。重組人p53腺病毒注射液(Recombinant Human Ad-p53 injection,深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備 應(yīng)用球囊損傷頸總動(dòng)脈結(jié)合高脂飲食喂養(yǎng)8周。8周末運(yùn)用體表彩色超聲方法證實(shí)頸總動(dòng)脈粥樣斑塊形成,利用p53基因腺病毒注射液局部轉(zhuǎn)染斑塊處制備易損斑塊模型[1],10周末藥物觸發(fā)以促使斑塊發(fā)生實(shí)驗(yàn)性破裂,觸發(fā)后處死。

球囊損傷:動(dòng)物麻醉后手術(shù)暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外分叉,將2.5 mm×15 mm的球囊導(dǎo)管經(jīng)頸外動(dòng)脈送入頸總動(dòng)脈約3 cm,4個(gè)大氣壓充盈球囊后回拉至頸內(nèi)、頸外分叉,反復(fù)回拉3次以造成內(nèi)膜損傷。

p53轉(zhuǎn)染:麻醉動(dòng)物,暴露頸總動(dòng)脈,經(jīng)注射器分別向轉(zhuǎn)染部位的管腔中注入 10 μ L滴度為1.5×1010pfu/mL的重組人p53腺病毒注射液,注射前結(jié)扎轉(zhuǎn)染部位上下兩端的血管10 min,然后恢復(fù)血供,在結(jié)扎部位做縫線標(biāo)記。靜脈給予抗生素預(yù)防感染。

藥物觸發(fā):參考Constantinide等[2]方法進(jìn)行藥物觸發(fā),10周末于各組動(dòng)物模型按CRVV0.15 mg/kg腹膜下注射,30 min后耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg,于處死動(dòng)物前24 h和48 h給予兩次藥物觸發(fā)。

1.4.2 分組及給藥方法 家兔18只作為模型組給予造模。8周末,將p53基因轉(zhuǎn)染造模成功家兔隨機(jī)分為3組,模型對照組、養(yǎng)心顆粒組、辛伐他汀組,每組6只;另取6只正常同齡同種系家兔作為空白對照組。

按人兔給藥劑量體表面積折算公式計(jì)算給藥量。各治療組于第9周開始給予藥物灌胃,養(yǎng)心顆粒組按0.643 g/kg粉末給藥,辛伐他汀按2.5 mg/kg給藥,每日灌服1次,連續(xù)灌服2周,空白對照組及模型對照組灌服同體積蒸餾水。

1.4.3 樣本采集 各組于實(shí)驗(yàn)第8周末、第10周末分別抽取家兔耳緣靜脈血3 mL,4 000 r/min離心8 min,分離血清,-20℃保存,按試劑盒方法測定血清IL-18含量。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0分析軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組比較采用F檢驗(yàn),兩兩比較采用q檢驗(yàn),同組前后比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

與空白對照組相比,各模型組在8周末IL-18含量明顯升高(P＜0.01);10周末,與模型對照組相比,各治療組 IL-18含量降低(P＜0.01);養(yǎng)心顆粒組IL-18含量低于辛伐他汀(P＜0.01)。養(yǎng)心顆?？擅黠@降低模型動(dòng)物血中IL-18的含量,且優(yōu)于辛伐他汀組。詳見表1。

表1 各組家兔血清IL-18含量比較(±s)pg/mL

表1 各組家兔血清IL-18含量比較(±s)pg/mL

組別 n 8周末 10周末空白組 6 29.40±0.93 29.35±0.852)模型對照組 6 62.32±1.481) 68.68±5.79養(yǎng)心顆粒組 6 64.05±3.341) 34.43±2.402)3)4)辛伐他汀組 6 65.48±1.441) 41.28±0.722)3)與空白組比較,1)P＜0.01;與模型對照組比較,2)P＜0.01;與本組8周末比較,3)P＜0.01;與辛伐他汀組比較,4)P＜0.01

3 討 論

易損斑塊是軟斑塊或非鈣化斑塊,具有薄纖維帽、大脂質(zhì)池、炎癥細(xì)胞浸潤且易發(fā)生破裂。炎癥反應(yīng)引起的斑塊表面內(nèi)皮脫落、覆蓋血栓、斑塊鈣化小結(jié)突出是易損斑塊導(dǎo)致血栓事件發(fā)生的重要因素[3]。IL-18是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有多向性效應(yīng)的促炎癥因子,它在炎癥反應(yīng)鏈中起著關(guān)鍵性的作用。IL-18主要位于斑塊巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),IL-18表達(dá)量隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展而增多,它不僅可以通過干擾素-γ(IFN-γ)和黏附分子在血管細(xì)胞上的表達(dá)抑制平滑肌細(xì)胞膠原合成,還可誘導(dǎo)至少兩種基質(zhì)降解酶的表達(dá),其中包括間質(zhì)膠原酶,該酶被認(rèn)為是支撐斑塊纖維帽中膠原纖維降解的決定因素[4]。IL-18還可以直接控制斑塊內(nèi)單核細(xì)胞聚集和細(xì)胞死亡,此為斑塊破裂和血栓形成的決定因子[5]。

養(yǎng)心顆粒是以養(yǎng)心湯為主方進(jìn)行加減而研制成的,主要成分有黃芪、茯神、半夏、當(dāng)歸等,其中人參、黃芪大補(bǔ)元?dú)?以扶心氣,茯神、遠(yuǎn)志健脾和胃,補(bǔ)心安神;柏子仁、酸棗仁、五味子養(yǎng)心安神而斂心氣,當(dāng)歸、川芍、半夏行氣活血,化痰祛疲;肉桂與甘草辛甘養(yǎng)陽;五味子、酸棗仁酸甘化陰,補(bǔ)氣活血藥與養(yǎng)心安神藥共同組方。本研究結(jié)果顯示,養(yǎng)心顆粒能明顯降低易損斑塊家兔血清IL-18的含量,與模型對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且養(yǎng)心顆粒組IL-18含量低于辛伐他汀組,這可能與養(yǎng)心顆粒能夠延緩動(dòng)脈硬化斑塊進(jìn)展,緩解因內(nèi)皮損傷引起的炎癥反應(yīng),進(jìn)而穩(wěn)定易損斑塊的作用機(jī)制有關(guān)。

[1]陳文強(qiáng),張運(yùn),張梅,等.外源性人野生型p53基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致兔動(dòng)脈硬化斑塊的不穩(wěn)定性[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(1):43-47.

[2]Constantinides P,Chakravarti RN.Rabbit arterial thrombosis production by systemic procedures[J].Arch Pathol,1961,72:197-208.

[3]吳惠玲,何國祥.“從易損斑塊至易損患者”的新概念[J].臨床心血管病雜志,2005,21(4):254-256.

[4]Gerdes N,Sukhova GK,Libby P.Expression of interleukin(IL)-18 and functional IL-18 recepto r on human vascular endothelial cells,smooth muscle cells,and macrophages;implications for atherogenesie[J].J Exp M ed,2002,195(2):245-257.

[5]謝江嬌,廖玉華.兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)IL-18表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].中國分子心臟病學(xué)雜志,2005,5(6):773-776.